辛开苦降法对NASH大鼠肝组织PPARα及L-FABPmRNA表达影响的实验研究

摘要

目的：以温病学湿热证理论为指导，从脾胃立论，以王氏连朴饮为基础方加味，观察辛开苦降法对非酒精性脂肪肝肝炎(NASH)大鼠肝组织过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)及肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)基因(L-FABPmRNA)表达的影响，探讨辛开苦降法调节实验性NASH大鼠脂质代谢相关因子，减轻脂类在肝脏的积聚，缓解氧化应激、脂质过氧化，保护肝细胞，改善肝功能的作用。从脂质代谢调节因子PPARα和L-FABP的相互关系研究NASH的病理机制;研究辛开苦降法对NASH的干预作用及其机理。从细胞和分子水平为NASH中医药防治理论提供理论依据。
　　 方法：清洁级SD大鼠40只，雌雄各半，体重190-210克左右，随机分为4组，分别为:A组:正常对照组B组:空白模型组C组:辛开苦降方防治组D组:西药对照组（东宝肝泰防治组）每组10只大鼠，常规饲养3天后，B、C、D三组予以基础饲料+高脂饲料（10％猪油、2％胆固醇）进行NASH造模，8周后各组在高脂饲料喂养同时，C组辛开苦降方1ml/100g/d灌胃，每日一次，D组予以东宝肝泰混悬液1ml(0.09g)，每日一次，AB组予以生理盐水1ml/100g/d灌胃，每日一次。各模型组给药4周后（即实验12周）以2％戊巴比妥钠溶液麻醉处死所有动物，迅速按常规分离血清及留取肝组织。检测血清指标:谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆固醇(TCH)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)等。取肝右叶，4℃下制成肝匀浆，按试剂盒操作说明分别测定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、游离脂肪酸(FFA)、谷胱甘肽转移酶(GSH-ST)含量，结果以每克肝组织的含量表示。肝组织病理观察:将肝组织用4℃生理盐水冲洗，在肝脏最大叶距边缘5mm处取小块肝组织，中性福尔马林固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察，评估脂肪变性和炎症活动程度。另小块肝组织放-80C冰箱冻存以备作western blot检测L-FABP。原位杂交技术检测肝组织PPARα、L-FABP mRNA的表达，显微镜下观察显色结果及摄影记录。用医学图象分析系统行图象分析，得出积分光密度。
　　 结果：
　　 1.各组大鼠肝功能和血脂比较:D组（东宝肝泰组）相比B组能够降低NASH大鼠的TG，TCH水平(p＜0.05);C组（辛开苦降方组）大鼠血清TG，TCH，ALT，AST水平较各模型组显著降低(P＜0.01)，作用优于D组(P＜0.05)2.NASH模型组大鼠肝组织出现中重度脂肪变、不同程度的炎细胞浸润及坏死，肝组织MDA含量较正常大鼠显著增高，肝匀浆SOD的活性明显降低，模型组较对照组肝组织PPARαmRNA下降(p＜0.05)和L-FABPmRNA表达显著增强(p＜0.01)。
　　 3.肝组织PPARαmRNA基因的表达于MDA含量呈明显正相关，与SOD和活性则呈明显负相关。L-FABPmRNA则相反。
　　 4.各组大鼠肝组织炎症活动程度、肝匀浆MDA含量、肝组织基因PPARαmRNA和蛋白表达均较模型组大鼠显著降低，肝匀浆SOD、的活性则较模型组大鼠明显增高。
　　 结论：
　　 1.辛开苦降方可以有效降低NASH模型大鼠的肝湿重、肝指数、血清ALT、AST、TC、TG及肝组织FFA水平，MDA含量（P＜0.01或P＜0.05），能提高NASH大鼠肝组织SOD活性(P＜0.01)，改善病理组织学变化，具有显著的抗脂肪氧化、抗炎作用。
　　 2.肝组织PPARα和L-FABP基因表达水平与NASH的形成和发展密切相关，辛开苦降方对模型大鼠肝组织PPARαmRNA表达明显增强(P＜0.05)，对L-FABP mRNA和蛋白表达减弱(P＜0.01)，二者之间呈负相关关系;
　　 3.辛开苦降方能够激活PPARα和L-FABP mRNA表达，纠正肝脏脂质代谢紊乱，阻止脂质过氧化反应，这可能是其防治NASH的重要分子机制;
　　 4.辛开苦降方增强大鼠PPARα和L-FABP基因的表达的同时亦不会使脂质过氧化作用对肝脏过多的损伤，故而最后能够保肝降酶、减少血脂、降低和防止脂肪肝形成的用途;
　　 5.从病理学改变、生化指标以及PPARα和L-FABP基因所表达结果而看，辛开苦降方防治NASH的效果均能够比东宝肝泰对照组有优势。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

实验研究

1．材料与方法

1．1 主要实验试剂及仪器

1．2 实验饲料及动物

1．3 实验主要药物及溶液配制

2．方法

2．1 分组与造模

2．2 给药方法

2．3 标本采取

2．4 指标测定及方法

3．结果

3．1 一般情况

3．2 血清生化测定

3．3 肝匀浆生化测定

3．4 肝脏病理

3．5 L-FABP蛋白的表达

3．6 原位杂交技术检测肝组织PPARα、L-FABP mRNA的表达

讨论

1．PPARα、L-FABPmRNA对NASH的作用机制

1．1 NASH的PPARα基因调控作用

1．2 L-FABPmRNA对NASH的作用

2．NASH的脏腑相互影响的机制

2．1 肝病与脾胃的关系

2．2 非酒精性脂肪性肝炎与脾胃湿热的关系

2．3 非酒精性脂肪性肝炎与肝肠对话

2．4 肥胖与中医脾胃的关系

3．辛开苦降法在NASH中的应用

3．1 辛开苦降法溯源及发展

3．2 辛开苦降法在脾胃中的应用机制

3．3 辛开苦降法的防治特点

3．4 辛开苦降法在NASH中应用的防治作用

4．王氏连朴饮组方分析

结语

参考文献

附录

综述

附图

致谢