温和灸对小鼠细菌感染炎症的影响及其自噬机制研究

摘要

目的: 巨噬细胞(Macrophage，Mψ)是来源于造血干细胞的具有杀伤、修复双重功能的高度可塑性分化细胞，驻留于几乎所有的器官组织中。在胞外微环境、内分泌、异源物质和衰老等条件刺激下，巨噬细胞能可逆性地分化为炎症杀伤(M1)和抗炎修复(M2)两种类型。正常的巨噬细胞功能是宿主防御、组织重建、免疫调节的中坚力量，失控的炎症反应是感染引起组织损伤和死亡的主要因素，而抗炎过度引起的免疫抑制则是各种慢性感染、代谢失调、癌症、自身免疫、衰老相关疾病的关键步骤。中医针灸具有双向良性调节作用而广泛应用于各种疾病的预防、治疗和防衰保健中，因此研究针灸对巨噬细胞的作用和机制对于了解针灸机理、提高针灸临床疗效和对现代疾病谱的适用具有重要意义。我们通过对比大量古代文献和现代研究发现，针灸很大一部分治疗作用与机体多系统、多中心、多层次的炎症与抗炎、疼痛与镇痛有关，但温和灸的抗炎作用明显不在此列。本课题以温和灸对金黄色葡萄球菌急性感染的治疗作用为切入点，围绕温和灸对巨噬细胞的吞噬、杀菌功能以及多种促炎、抗炎细胞因子表达的影响，探讨温和灸对于细菌感染和炎症的整体调节作用及机制，及更深层次的细胞自噬通路机制，为针灸的临床应用提供实验依据。 方法: 1.温和灸对金黄色葡萄球菌致死性感染的保护作用:SPF级昆明小鼠雄性40只，体重18～22克，随机分为四组:A、空白对照组;B、模型组;C、艾灸15min组;D、艾灸30min组，每组10只。除空白对照组外，其余30只腹腔注射6％淀粉肉汤2天后再腹腔注射金黄色葡萄球菌作为感染模型。感染后模型组不做处理，C、D两组分别于感染后1小时艾灸小鼠关元穴15min和30min。随后持续48h观察和记录小鼠死亡情况，绘制生存力曲线。小鼠死亡后立即取腹腔液梯度稀释后用琼脂平板计数菌落数，定量观察细菌感染程度。解剖所有小鼠称重检测反映炎症程度的胸腺指数、脾指数。 2.温和灸对巨噬细胞杀菌活性和炎症细胞因子表达的影响:(φ)感染后即刻艾灸对巨噬细胞杀菌活性的影响。SPF级昆明小鼠雄性24只随机分为三组:模型组;内对照组;即刻艾灸组。所有小鼠腹腔注射6％淀粉肉汤2天后再腹腔注射大肠杆菌(MOI=20)作为感染模型，模型组感染后0h处死，内对照组感染后2h处死，即刻艾灸组感染后立即艾灸关元穴0.5h并于2h处死。各组取腹腔液梯度稀释后用琼脂平板计数菌落数。(φ)感染吞噬后艾灸对巨噬细胞杀菌活性的影响。SPF级昆明小鼠雄性32只随机分为四组:A、模型组;B、内对照组;C、艾灸0.5h组;D、艾灸1h组。所有小鼠腹腔注射6％淀粉肉汤2天后再腹腔注射大肠杆菌(MOI=20)作为感染模型，模型组感染后0h处死，内对照组感染后4h处死，C、D两组感染1h后分别艾灸关元穴0.5h和1h并于4h处死。各组取腹腔液梯度稀释后用琼脂平板计数菌落数。(φ)感染吞噬后艾灸对炎症细胞因子表达的影响。SPF级昆明小鼠雄性16只，分组和处理同(φ)，各组于感染后6h处死取腹腔巨噬细胞，提取总RNA逆转录后用qRT-PCR定量检测15种炎症相关因子和炎症体蛋白caspase-1的表达水平。 3.温和灸对巨噬细胞自噬和自噬信号通路的影响:SPF级昆明小鼠雄性40只随机分为四组:A、空白对照组;B、模型组;C、艾灸0.5h组;D、艾灸1h组。除空白对照组外，其余30只艾灸实验前2天腹腔注射6％淀粉肉汤作为巨噬细胞活化模型，2天后对C、D两组分别艾灸关元穴0.5h和1h后处死小鼠。每组取腹腔液细胞经固定免疫荧光染色和悬浮免疫荧光染色后分别用普通荧光显微镜和激光共聚焦荧光显微镜观察含LC3染色的自噬体光点的计数变化。随后提取腹腔液细胞总蛋白用Western blot检测磷酸化Akt和eIF2α含量变化。 结果: 1.金黄色葡萄球菌致死感染后，艾灸30min组显著提高48h内的生存率(P＜0.05)，艾灸15min组生存率有所提高但差异不显著(P＞0.05)。 感染致死后，艾灸15min组、艾灸30min组腹腔细菌感染程度与模型组比较明显减轻(P＜0.05，P＜0.01)，艾灸时间长者感染较轻(P＜0.05)。 致死感染后模型组与空白组对比胸腺与脾脏指数变大(P＜0.01)，艾灸30分钟组显著减小胸腺与脾脏指数(P＜0.01)，艾灸15min组也使胸腺(P＜0.05)与脾脏指数减小(P＜0.01)。艾灸时间长者脾脏指数更小(P＜0.05)。 2.在20=MOI大肠杆菌感染后即刻艾灸组杀菌活性为31.6％，与内对照组的68.3％相比反而有所下降(P＜0.05)。感染后允许巨噬细胞吞噬1h后艾灸的杀菌活性与内对照组比较显著上升(P＜0.01)，艾灸1h组杀菌活性比艾灸0.5h组升高明显(P＜0.05)。 内对照组与模型组比较，所检测的16个基因中除TGFb，Fizzl，IF1204等基因被下调外，其余炎症因子基因表达均不同程度的上调，其中IL-1β和iNOS分别被上调100和500倍。 与模型组比较，从艾灸0.5h至1h之间， IL1α和IL1β先轻微上调(P＜0.05)然后下调(P＜0.01)，TNFα基因表达持续下降(P＜0.05)。iNOS和IL10开始变化不大之后显著下调(P＜0.01)。内对照组与模型组比较炎症体蛋白caspase-1表达量约提高6倍，艾灸0.5h和1h均使caspase-1基因表达下降(P＜0.05)。艾灸后其余10个基因表达变化差异不显著。 3.在空白对照组和模型组中，自噬标志物LC3光点数为较低的本底水平;普通荧光显微镜下，艾灸0.5小时或1小时后，小鼠腹腔巨噬细胞胞质中的LC3颗粒变多，在细胞质中形成弥散的颗粒状分布，数量与未艾灸对照活化组的差异具有统计学意义(P＜0.01)，说明自噬水平显著增加。激光共聚焦结果与普通显微镜一致，并且显示艾灸1h情况下细胞核具有分叶、弥散状况，可能与自噬过度引起的凋亡有关。 模型组与空白对照组比较，mTOR通路中的Akt磷酸化上调可以抑制自噬活化，mTOR非依赖通路的eIF2α磷酸化上调可以诱导自噬活化，二者结合的情况下自噬活化增加不多。 与模型组比较，艾灸0.5h组和艾灸1h组使Akt磷酸化下调，eIF2α磷酸化上调，故起到了全面激活自噬的作用，艾灸促进自噬的作用与mTOR依赖的p-Akt的下调和mTOR非依赖的p-eIF2α的上调均有关。 结论: 1.以致死剂量的金黄色葡萄球菌感染小鼠腹腔诱发的动物死亡与感染的持续存在、器官的炎症损伤过度均有关，艾条温和灸可以起到使小鼠死亡率显著下降、细菌感染减少、炎症损伤减轻的保护作用，效果与时间正相关，表明温和灸有明显的抗细菌感染、抗炎作用。 2.温和灸的抗细菌感染作用发生在细菌被巨噬细胞吞噬步骤之后，过早艾灸不利于感染的清除。在巨噬细胞吞噬细菌之后进行艾灸能显著地提高巨噬细胞的杀菌活性，显著性与艾灸时间呈正相关，但是过长时间的艾灸有可能对巨噬细胞不利。温和灸的作用主要是抑制炎症，这可能是温和灸作用机制不同于针刺、直接灸之处。 3.温和灸诱导巨噬细胞内自噬反应显著上升。温和灸对自噬的激活作用与Akt磷酸化下调和eIF2α磷酸化上升有关。温和灸的温热效应可能通过多个途径促进自噬，加快对内吞细菌的清除，是一种不依赖于免疫炎症活化的杀菌抗炎过程，对引起组织损伤的急性感染和过度炎症能够实施有效的干预，对于温和灸单独和与其它方法协同应用于多种感染、炎症、免疫异常相关疾病提供了理论根据。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

实验一 温和灸对小鼠感染金黄色葡萄球菌的保护作用

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

实验二 温和灸对小鼠巨噬细胞杀菌作用与炎症因子表达的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

实验三 温和灸对小鼠巨噬细胞自噬通路的影响

1 材料和方法

2 实验方法

3 统计学方法

4 结果

3 讨论

讨论与展望

参考文献

文献综述 一．从艾灸看中医与现代医学前沿对接

文献综述 二．针灸抗感染性疾病的研究进展

发表论文

致谢