艾迪注射液联合小剂量化疗治疗食管鳞状细胞癌的实验及临床研究

摘要

食管癌(Esophageal carcinoma)是我国最为常见的恶性肿瘤，其发病率、死亡率分别列在全国十大恶性肿瘤的第5位、第4位，根据我国“2012中国肿瘤登记年报”中的数据显示中原地区如河南、河北等正是我国食管癌的高发地区[1]。与此同时，流行病学资料显示，我国食管癌的发病率及死亡率农村地区远高于城市地区，男性比例均远高于女性，且中年以后食管癌的发病率以及死亡率逐步提高，不仅如此，就诊时大部分食管癌患者已处于癌症的中晚期，预后极其不佳[2]。近些年来，食管癌新辅助化疗方案的在临床上得到广泛应用，并较单纯手术切除治疗疗效更胜一筹。尽管临床各类一线化疗药物均对食管癌细胞拥有较显著的杀伤作用，但是，由于我国的食管癌细胞大多为分化程度差异较大的鳞癌细胞[3]，与西欧国家以食管腺癌多见所不同，因而容易对顺铂、紫杉醇、5-氟尿嘧啶等一线化疗药物的敏感不是很高，且长期或大剂量使用化疗药物后，常常对正常组织造成不可逆性毒副作用，产生例如骨髓、胃肠道、免疫等诸多方面的不良反应，进而使得部分肿瘤患者生活质量发生下降，甚至会因此导致治疗疗程的中断最终导致化疗耐药的发生，更甚者，会造成一些患者死于化疗药对正常组织的毒副作用而并非食管癌的原发病[4]。怎样克服食管癌患者治疗过程中极易发生的多药耐药，并在不减弱抗肿瘤效果的同时降低化疗药物对食管癌患者的毒副作用已成为食管癌化疗过程中迫切需要解决的问题[5]。
　　艾迪注射液是我们独特的中药复方制剂，其与化疗药物联合应用可达到降低毒性，提高疗效的目的[6]，其作用机制是值得探讨的。因此，我们将不同剂量的艾迪配合10g·L-1顺铂应用于食管癌Eca-109细胞系，以调查艾迪注射液能否增强顺铂对食管癌Eca-109细胞株的细胞毒性，并检测与凋亡密切相关的基因Bcl-xl\Bax mRNA的变化情况，为食管癌的联合治疗的最佳模式提供理论依据，探索二者发挥协同抗肿瘤效应的有关作用机制。
　　目的:
　　研究与探讨中药制剂艾迪注射液联合小剂量化疗对食管癌化疗的增效作用及其相关作用机制。
　　方法:
　　1.实验研究
　　以不同浓度艾迪、顺铂10g·L-1及两药联合作用于食管癌Eca-109细胞株。采用MTT法来检测不同浓度艾迪与DDP单独或联合应用对食管癌Eca-109细胞的增殖抑制率，采用荧光染料Hoechst33342来检测细胞形态学改变，采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞仪来分析凋亡细胞所占比例，采用RT-PCR方法来分析凋亡相关基因Bcl-xl、Bax mRNA的表达的变化。
　　2.临床研究
　　将86例食管鳞状细胞癌患者随机分为观察组（44例）和对照组(42例)，对照组用常规剂量PF方案化疗。观察组44例在小剂量化疗（化疗方案同对照组，剂量为常规剂量的80％）同时联用艾迪注射液。治疗2个周期后，比较两组患者的近期疗效的差异、症状改善的差异、生活质量变化的差异以及化疗毒性轻重程度的差别。
　　结果:
　　1.实验研究结果
　　1.1顺铂、艾迪单用或联合使用对Eca-109细胞增殖抑制率的影响
　　MTT实验结果显示单用顺铂组对Eca-109细胞的增殖抑制率分别为37.542±0.253％、52.785±0.516％、69.952±8.236％，单用艾迪组对Eca-109细胞的增殖抑制率分别为8.571±0.375％、16.214±1.375％、29.431±0.794％，艾迪与顺铂合用组对对Eca-109细胞的增殖抑制率分别为54.360±0.486％、56.516±0.379％、63.378±0.263％、59.070±7.151％、62.182±1.029％、66.357±7.317％、73.057±0.631％、73.586±0.158％、76.824±0.251％。
　　1.2顺铂、艾迪单用或联合使用对Eca-109细胞凋亡形态学改变的影响
　　空白对照组细胞株的细胞核为圆形或椭圆形细胞核，大小均匀，染色质分布较均匀，在紫外光下透出蓝色荧光。顺铂单用组、艾迪单用组以及顺铂艾迪联合处理组的细胞株显示出比空白对照组更强的蓝色颗粒状荧光，细胞形态改变显著，可表现出各种不同程度的收缩、变形，且细胞质浓缩、细胞核染色质凝集、核固缩、部分核碎裂和较明显的凋亡小体，随着药物使用剂量的递增，这样的细胞的数量也随之逐渐增多。
　　1.3顺铂、艾迪单用或联合使用对Eca-109细胞凋亡百分率的影响
　　实验结果显示，细胞凋亡百分比从A组到G组依次为(0.53±0.16)％、(0.79±0.11)％、(1.16±0.95)％、(1.26±0.17)％、(1.43±0.25)％、(2.47±0.33)％、(5.31±0.21)％、(5.79±0.27)％。我们发现，在逐渐增加艾迪浓度的条件下，早期凋亡细胞的比例也随之增多，表明艾迪是以剂量依赖的方式促进食管癌细胞发生凋亡，且当艾迪浓度增加到一定程度时，细胞凋亡百分率改变有显著统计学差异（P＜0.01）;将顺铂10g·L-1与不同浓度艾迪联合应用时所诱导的凋亡率与仅用10g·L-1顺铂所诱导的凋亡率相比，可以发现当顺铂浓度一定时，可以通过增加艾迪的使用剂量来增加食管癌细胞的凋亡率，与此同时，随着艾迪使用剂量的增加，坏死细胞呈现出进行性增多的趋势。
　　1.4顺铂、艾迪单用或联合使用对Eca-109细胞Bax、Bcl-xlmRNA表达含量改变的作用
　　实验结果如下，与空白对照组比较，各组均具有统计学差异（aP＜0.05，bP＜0.01）;Bax mRNA的表达情况如下:顺铂10g·L-1联合艾迪25ml·L-1、50ml·L-1、100ml·L-1组与仅用顺铂10g·L-1组灰度值相比后进行统计学分析得出t值分别为-2.457、-6.031、-9.220，具有极显著性统计学差异，P=0.020、0.000、0.000（cP＜0.01）(n=3); Bcl-xlmRNA的表达情况如下:顺铂10g·L-1联合艾迪25ml·L-1、50ml·L-1、100ml·L-1组与仅用顺铂10g·L-1组灰度值相比后进行统计学分析得出t值分别为2.457、7.888、9.611，具有统计学差异，均P=0.000(cP＜0.01）。
　　2.临床研究结果
　　2.1近期疗效评定
　　观察组和对照组的总有效率依次为22.72％、28.58％，稳定率依次为84.09％、78.57％。两组治疗后均无完全缓解病例，观察组的部分缓解者，稳定者均略高于对照组，经检验x2=0.448，均不具有统计学差异(P＞0.05)，两组患者近期疗效的总有效率及稳定率相比，经检验x2=0.015，均无显著性差异(P＞0.05)。
　　2.2临床症候改善情况比较
　　观察组与对照组进行比较，胸骨后疼痛及吞咽困难2个临床症状显著改善，经检验x2=8.863，具有明显的统计学差异(P＜0.05)。
　　2.3生存质量评价
　　治疗后将两组患者的生活质量评分变化进行比较，观察组的有效率为90.91％，对照组为76.19％。经检验，x2=8.165，具有明显的统计学差异(P＜0.05)。由此可知，观察组在改善患者的生活质量方面较对照组更好。
　　2.4毒性反应评价
　　观察组及对照组Ⅱ度及Ⅱ度以上白细胞减少的发生率分别为20.45％(9/44)、33.33％(14/42)，经检验，x2=4.338，具有明显的统计学差异(P＜0.05);观察组及对照组Ⅱ度及Ⅱ度以上血小板降低的发生率分别为6.82％(3/44)、16.67％(7/42)，经检验，x2=4.735，具有明显的统计学差异(P＜0.05)。血小板降低及胃肠道反应比较差异均无统计学意义（P＞0.05）.
　　结论:
　　1.艾迪能抑制食管癌Eca-109细胞的增殖，并呈现出显著浓度依赖性，但即使将艾迪的使用剂量增加至很大的剂量，对食管癌细胞的抑制率还没有达到半数，这表明它的抗肿瘤效果并没有想象中那么强大，与传统的化疗药物的细胞毒性效果之间还存在着较大的差距。
　　2.顺铂对食管癌Eca-109细胞增殖的抑制效果也表现出与艾迪类似的剂量依赖性。而当10g·L-1顺铂与不同浓度的艾迪共同作用时，增加艾迪注射液的使用剂量，会显著增强顺铂对食管癌Eca-109细胞增殖的杀伤
　　作用（P＜0.01）。
　　3.当10g·L1顺铂与不同剂量的艾迪共同作用时，增加艾迪注射液的使用剂量，也表现出协同顺铂诱导食管癌Eca-109细胞发生调亡，不论是从细胞组织形态学改变还是凋亡细胞百分比的变化来看，均具有较明显的统计学差异(P＜0.01）。
　　4.当10g·L-1顺铂与不同剂量的艾迪联合使用时，比仅用10 g·L-1顺铂更能显著性上调促凋亡基因的表达、下调抗凋亡基因的表达，且均有极显著性的差异（P＜0.01)。
　　5.两组患者近期疗效的总有效率及稳定率相比，经检验x2=0.015，均无显著性差异(P＞0.05)。观察组较对照组的主要临床症状显著改善，经检验x2=8.863，具有明显的统计学差异(P＜0.05)。且观察组在改善患者的生活质量方面较对照组更好(P＜0.05)。观察组Ⅱ度及Ⅱ度以上白细胞减少、血小板降低的发生率均低于对照组（P＜0.05）。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

实验研究

1 实验材料

2 实验方法

3 实验结果

基础实验结果附图

临床研究

1．临床资料

2．研究方法

3．研究结果

临床研究结果附图

讨论

1 中医对食管癌病因病机、治则方药的研究

2 艾迪注射液的组方分析及其有效成分的现代药理学研究

3 中药诱导肿瘤细胞凋亡的机制

4 选择艾迪注射液的临床意义

5 选择凋亡基因Bcl-xl、Bax的意义

结语

参考文献

附录

附录1(综述)：中药诱导肿瘤细胞凋亡的最新研究进展

附录2：WHO实体瘤疗效评价标准及Karnofsky评分量表

附录3：抗癌药物急性及亚急性毒性反应分度标准(WHO)

附录4：学习期间发表的论文及参加科研工作情况

致谢