Klotho基因在糖尿病肾病小鼠模型的表达及肾安颗粒的干预作用

摘要

糖尿病肾病（DN）是糖尿病(DM)代谢异常引发的肾小球硬化症，是国内外引起终末期肾病（ESRD）的常见病因。由于DN患者机体存在及其复杂的代谢紊乱，一旦发展至ESRD，治疗上往往更加困难，因此，探索其发病机制，以制定更加行之有效的防治手段，已成为当前内分泌学界和肾脏病学界迫切的愿望。
　　目的:建立DN小鼠模型并检测血生化变化情况,探讨 Klotho（KL）基因在DN小鼠的表达及肾安颗粒的干预作用。
　　方法:62只C57BL／6小鼠随机分成：正常对照组（A组，n=12），模型组(B组，n=12)、氯沙坦组(C组，n=12)、肾安颗粒低剂量组(D组，n=13)、肾安颗粒高剂量组(E组，n=13)。予链脲佐菌素（STZ）150 mg/kg单次腹腔注射造成糖尿病肾病模型。进行药物干预治疗，正常对照组及模型组小鼠灌服蒸馏水10ml/(kg2 d)；氯沙坦组灌服氯沙坦混悬液，剂量为为10ml/(kg2d)；肾安颗粒高、低剂量组均灌服肾安颗粒混悬液，剂量分别为4ml/(kg2d)及8ml/(kg2d)。药物干预时间为8周。用药前后检测各组小鼠血、尿生化。采血结束后，左肾制作光镜、电镜切片；右肾-70℃冰箱冻存备用，采用RT-PCR检测小鼠肾脏 KL mRNA的表达；采用Western-blot检测肾脏KL蛋白、Wnt1蛋白、β-catenin蛋白、nephrin蛋白、E-cadherin蛋白。
　　结果:药物干预期间，4只小鼠死亡，最终共58只小鼠纳入实验。给药前：B组、C组、D组、E组血、尿生化与A组比较明显升高；B组、C组、D组、E组组间比较无明显差异。给药后：A组血、尿生化与给药前无明显差异；B组血、尿生化与给药前比较明显升高；C组、D组、E组尿生化、肾功能、血脂与给药前比较明显降低,但肝功能给药前比较无明显差异；肾脏病理：A组肾组织结构正常。B组肾小球肥大，毛细血管基底膜弥漫增厚，系膜基质增生，少量系膜细胞增生，足突融合、甚至脱落、纤维化明显、球囊扩张明显。药物干预治疗后肾脏病理结构较B组改善。
　　各组小鼠肾脏KL mRNA及KL蛋白：B组、C组、D组、E组KL mRNA及KL蛋白与A组比较明显下降；C组、D组、E组与B组比较明显增强；C组与 E组表达相当，但较 D组上调。Wnt1蛋白及β-catenin蛋白：B组、C组、D组、E组Wnt1及β-catenin蛋白表达与A组比较明显增多；C组、D组、E组与B组比较明显减少；C组与E组表达相当，但较D组下调。nephrin蛋白：B组、C组、D组、E组nephrin蛋白表达与A组比较明显减少；C组、D组、E组与B组相比较明显增多；C组与D组表达相当，但较E组下调。E-cadherin蛋白：B组、C组、D组、E组E-cadherin蛋白表达与A组比较明显减少；C组、D组、E组与B组相比较明显增多；C组与E组表达相当，但较D组下调。
　　结论:
　　1.单次腹腔注射STZ(150mg/kg)能成功诱导C57BL／6小鼠DN模型。
　　2.糖尿病肾病模型小鼠发生蛋白尿、肾功能异常、糖及脂质代谢异常。
　　3.肾安颗粒具有改善肾功能、减少蛋白尿、调节血糖及血脂代谢的作用，能延缓糖尿病肾病的进展。
　　4.KL基因在DN小鼠模型的肾组织中表达下降，与 Wnt1蛋白、β-catenin蛋白呈明显负相关，与nephrin蛋白、E-cadherin蛋白呈明显正相关，肾安颗粒可能通过上调 KL基因的表达，抑制 wnt/β-catenin通路的异常激活，抑制足细胞EMT，从而保护足细胞，改善蛋白尿及肾小球硬化,延缓糖尿病肾病的发展进程。

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中英文缩略词表

前言

材料与方法

1. 材 料

2.实验方法

3.统计学分析

结果

1.各组小鼠精神状态、饮食量、尿量、皮毛色泽、体重比较

2.各组小鼠给药前后24小时尿量、24小时尿白蛋白定量检测结果

3.各组小鼠给药前后空腹血糖检测结果

4.各组小鼠给药前后BUN、Scr检测结果

5.各组小鼠给药前后TP、ALB检测结果

6.各组小鼠给药前后CHOL、TG检测结果

7.光镜下观察各组小鼠肾组织超微结构

8.电镜下观察各组小鼠肾小球情况

9.Real-time PCR检测各组小鼠肾皮质KLotho mRNA的表达情况

10.Western-bolt检测各组小鼠肾皮质相关蛋白的表达

讨论

1.C57BL/6小鼠DN模型评价

2.中医对糖尿病肾病的认识

3.肾安颗粒的组方分析

4.Klotho基因

5.Wnt信号转导通路

6. Klotho与Wnt/β-catenin信号转导通路的关系

7.肾安颗粒对DN中KL表达的调控

结论

参考文献

文献综述: Klotho基因抑制糖尿病肾病中Wnt信号通路诱足细胞损伤的作用及机制

读研期间发表论文情况

附图1

附图2

致谢