头针对脑缺血再灌注大鼠脑组织血管新生影响的相关机制研究

摘要

脑卒中是目前严重危害我国中老年人生命与健康的疾病，本病突出表现为高发病率、高致残率、高死亡率、高复发率，每年我国有200万人新发脑卒中，150万人死于脑卒中，其中脑梗死占了全部脑卒中的60～80％，因其居高不下的致死率及致残率给国家和众多家庭造成沉重的经济和生活负担，故其已成为现代医学研究的热点课题。大量研究证明，缺血性脑损伤是一系列复杂的多环节的病理生理变化过程，早期主要以自由基产生、脑水肿、兴奋性氨基酸毒性为主；中期以炎症、神经元凋亡为主；后期以神经再生、血管新生和胶质细胞增殖等脑重构表现为主。
　　脑缺血后，血管新生是脑微循环修复重建的一个重要病理生理过程。血管新生的程度与卒中后神经功能恢复的程度成正相关。血管内皮生长因子（VEGF）是目前发现的最强有力的血管形成因子。研究表明，脑缺血、缺氧可诱导血管内皮生长因子及其受体的表达，应用外源性VEGF可促进脑缺血半暗带新生血管的形成，并减少脑梗死体积；环氧化酶-2(COX-2)是花生四烯酸转化为前列腺素过程中的重要限速酶。近年来大量研究表明，COX-2是参与血管新生的重要因子之一；血管生成素(angiopoietins，Ang)是一族特异性作用于血管内皮细胞的生长因子，它们与血管内皮凋亡、血管形成后期的成熟、稳定性及重建方面均具有极大的相关性。近年来诸多研究均证实，三者对血管新生有重要作用，是近年来国际上兴起的新的研究领域，但其中有关中医药、针灸的促血管生成作用的研究相对较少，尤其是关于头针的促血管新生的研究鲜有报道。
　　目的：根据上述分析，本研究在大鼠局灶性脑缺血模型的基础上，采用改良线栓法制备MCAO模型，拟“醒脑开窍，祛瘀生新”为治则，取顶颞后斜线、顶颞前斜线，通过观察头针对局灶性脑缺血再灌注大鼠缺血脑组织微血管超微结果的影响，以及对VEGF、COX-2、Ang-1三者表达的影响，从而探讨头针疗法对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠脑内血管新生影响的可能作用机制。
　　方法：将清洁级SD雄性大鼠100只随机分为模型组（按缺血再灌注6h、24h、48h、96h分4组）、头针组（缺血再灌注6h、24h、48h、96h分别加电针刺激，分4组）、假手术组（大鼠麻醉切开颈部皮肤后，仅分离CCA及IPA至PPA，不插线栓）、正常对照组（大鼠不予处理，正常给水给食），每组10只。各组大鼠采用Zea-Longa评分方法，随相应时相评定动物神经功能缺损。分别采用免疫组化SABC法检测脑缺血再灌注后各时间点因子Ⅷ相关抗原(FⅧR：Ag)的表达，采用RT-PCR技术检测各组大鼠脑组织缺血半影区内Ang-1mRNA的表达水平，采用免疫组化法检测各组大鼠脑组织缺血半影区内VEGF、ES的表达水平，采用酶联免疫吸附（ELISA）法、荧光定量PCR检测检测各组大鼠脑组织缺血半影区内COX-2的表达水平。结果：（1）大鼠局灶性脑缺血再灌注后，头针组和对照组大鼠均出现神经功能障碍，主要表现有：脑梗死灶对侧前肢内收、肩内旋，提尾悬空时左前肢不能伸直或紧贴胸壁，行走时向右侧转圈、倾倒，肌张力降低等。采用Zea-Longa评分方法，24h后头针组和对照组大鼠CI/RP后神经功能均逐渐恢复，但头针组较对照组大鼠恢复得更好，在96h时差异最为显著。（2）采用免疫组化SABC法检测FⅧR：Ag，头针组与模型组比较，FⅧR：Ag在脑微血管的表达在缺血后24h开始增加(P＜0.05)并持续上升，脑缺血后96h的差异具有极显著的统计学意义(P＜0.01)，头针治疗随时间的延长可使其表达持续升高。由此可见头针治疗能够有效促进脑组织缺血半影区内微血管的新生，并且具有明显的累加蓄积效应。（3）采用免疫组化法检测Ang-1mRNA，正常对照组、假手术组Ang-1mRNA中等量表达，与模型组比较，头皮针组各时间点大鼠脑组织Ang-1mRNA含量均相对增多，其中脑缺血再灌注48h Ang-1mRNA含量达高峰，与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.01，P<0.05）；（4）采用免疫组化法检测 VEGF及ES，正常对照组、假手术组VEGF中等量表达，与模型组比较，头皮针组各时间点大鼠脑组织 VEGF含量增多，ES含量减少，其中脑缺血再灌注48h VEGF含量达高峰，24h ES含量达最低峰，与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.01，P<0.05）；（5）采用酶联免疫吸附（ELISA）法、荧光定量PCR检测COX-2，正常对照组、假手术组COX-2少量表达，于模型组比较，头皮针组各时间点大鼠脑组织COX-2 mRNA及蛋白含量均减少，差异均有统计学意义（P<0.05），其中脑缺血再灌注24hCOX-2 mRNA含量、96h COX-2蛋白含量与模型组比较，差异最为显著（P<0.01）。
　　结论：取顶颞后斜线、顶颞前斜线，使用头针治疗局灶性脑缺血再灌注大鼠，可增加FⅧR：Ag、VEGF、Ang-1的表达，减少ES、COX-2的表达，从而促进脑组织缺血区血管新生，减少脑缺血区损伤，对缺血脑组织有保护作用。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

缩略词表

前言

参考文献：

实验一 头针对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑微血管超微结构及新生影响的观察

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献:

实验二 头针对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织Ang-1mRNA的影响

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献：

实验三 头针对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织VEGF及ES表达的影响

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献：

实验四 头针对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织COX-2表达的影响

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献：

讨论

1.西医对脑缺血血管新生的研究

2.中医学对脑缺血血管新生的研究

3.模型的选择及评价

4.选穴依据

5.创新与特色

6.问题与展望

参考文献

结语

附录

文献综述1: 血管内皮生长因子的研究进展

文献综述2: 头针治疗缺血性脑血管疾病的研究概况

致谢