miR-155靶向CARHSP1参与动脉粥样硬化泡沫细胞形成的分子机制

摘要

目的：通过检测动脉粥样硬化患者血浆、斑块组织以及泡沫细胞中miR-155的相对表达水平，探讨miR-155参与动脉粥样硬化发生发展的分子机制。
　　方法：1.应用PMA刺激THP-1分化形成巨噬细胞，随后用ox-LDL处理，建立动脉粥样硬化泡沫细胞模型，应用实时荧光定量PCR技术（qRT-PCR）检测泡沫细胞中与心血管疾病密切相关的7个miRNA的表达水平，筛选出升高最明显的 miRNA；2.收集 AS患者和正常对照血浆标本，利用qRT-PCR技术检测miR-155的相对表达水平；并收集AS患者组织斑块和正常血管组织，检测两组标本中 miR-155的相对表达差异；3.应用 PMA刺激THP-1分化形成巨噬细胞后，用不同浓度ox-LDL处理不同时间，观察 miR-155的表达量随泡沫细胞沉积脂质的量和时间变化而变化的趋势4.应用脂质体转染技术将miR-155的mimic或inhibitor转染泡沫细胞，应用ELISA技术检测炎症因子TNF-α的含量，并用油红O染色技术检测泡沫细胞沉积脂质能力；5.用bioinformatics软件Miranda、PicTar、TargetScan等预测miR-155的靶基因，并用双luciferase reporter assay技术验证miR-155直接靶向CARHSP1；6.利用siRNA基因干扰技术或过表达质粒转染技术将CARHSP1 siRNA或CARHSP1过表达质粒转染到泡沫细胞并检测 CARHSP1经敲低或过表达后炎症因子 TNF-α的含量和泡沫细胞吞脂能力；7.利用western blot技术检测miR-155 mimic或inhibitor转染后，泡沫细胞中miR-155的靶基因CARHSP1及下游炎症因子表达情况。8.应用TRANSFAC数据库结果预测能与miR-155启动子结合的转录因子及其结合位点，应用ChIP方法和报告基因技术和荧光素酶报告基因技术验证转录因子NF-κB可以转录调控miR-155的表达。
　　结果：1.miR-155在泡沫细胞模型中升高是最明显的；2.miR-155在AS患者血浆中的相对表达量明显高于正常对照；miR-155在AS斑块组织中的表达量也明显高于正常血管组织；3.miR-155在泡沫细胞中的表达量随泡沫细胞摄食脂质的量增多而升高，同时也随泡沫细胞吞脂时间的延长而升高；4.miR-155能降低炎症因子TNF-α的含量并且减弱泡沫细胞沉积脂质的能力；5.Bioinformatics软件预测结果表明CARHSP1是miR-155的靶向基因之一，报告基因技术验证miR-155直接靶向作用CARHSP13’UTR；6.CARHSP1被抑制表达后能明显的抑制炎症因子 TNF-α释放，而CARHSP1过表达能促进炎症因子 TNF-α释放，其中的机制主要是CARHSP1能促进TNF-α mRNA的稳定性；7.在泡沫细胞中，miR-155通过直接靶向作用于 CARHSP1从而间接抑制炎症因子 TNF-α的表达来减缓动脉粥样硬化炎症反应，进一步削弱泡沫细胞吞脂能力；8.由炎症因子TNF-α等刺激活化的转录因子NF-κB可以与miR-155启动子区结合并转录调节miR-155的表达，使得miR-155的表达升高。
　　结论：miR-155在AS病人体内表达升高，升高的miR-155可以通过miR-155–CARHSP1–TNF-α这个负反馈信号通路减缓AS相关的炎症反应以及抑制泡沫细胞的形成，从而在AS进程中发挥保护性的作用。

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英文缩略语表

前言

1材料与方法

1.1主要实验仪器

1.2实验材料

1.2.1 实验对象

1.2.2 主要实验试剂

1.2.3 质粒和菌株

1.2.4 相关引物合成

1.2.5 试剂配制

1.3 实验方法

1.3.1 THP-1、HEK-293T细胞培养

1.3.2提取THP-1细胞RNA

1.3.3实时荧光定量PCR检测细胞miR-155的相对表达水平

1.3.4 泡沫细胞油红O染色

1.3.5 报告基因质粒构建

1.3.6 CARHSP1表达质粒的构建

1.3.7Luciferasereporter assay验证靶基因

1.3.8 western blot技术检测不同蛋白表达情况

1.3.9 染色质免疫共沉淀技术（ChIP）验证NF-κB与miR-155启动子区结合

1.3.10mRNA stability assay验证CARHSP1维持TNF-α mRNA的稳定性

2实验结果

2.1 miR-155在AS泡沫细胞模型中表达升高

2.2 miR-155在AS病人血浆和斑块组织中升高

2.3miR-155在泡沫细胞形成过程中通过抑制 TNF-α的表达来削弱脂质沉积和炎症反应

2.4CARHSP1是miR-155的一个功能性的靶基因

2.5CARHSP1能维持TNF-α mRNA的稳定性

2.6 AS炎症反应过程时，炎症因子TNF-α活化转录因子NF-κB入核并转录调控miR-155的表达

3实验讨论

结语

参考文献

附录1 综述: miRNA在心血管疾病中的研究

附录2攻读硕士学位期间的科研论文及学术交流获奖情况

致谢