丹参酮ⅡA对大鼠急性脊髓损伤保护作用及其机制研究

摘要

目的：
　　通过研究丹参酮ⅡA联合甲基强的松龙对ASCI后脊髓组织及神经元的保护作用，探讨丹参酮ⅡA能否替代或部分替代甲基强的松龙治疗ASCI，达到减少甲基强的松龙的用量，而又能获得相似的神经保护作用。同时通过研究丹参酮ⅡA对 ASCI后轴突再生过程中相关抑制信号通路RhoA/ROCKII/MLC的影响，从传统中药中寻促进ASCI后轴突再生的有效成分。
　　方法：
　　第一部分：大鼠大脑星形胶质细胞和脊髓神经元分层共培养体系的建立，通过分层培养的方法建立大鼠大脑星形胶质细胞和脊髓神经元共培养体系，经免疫荧光染色鉴定，用于进一步实验研究。
　　第二部分：丹参酮ⅡA联合甲基强的松龙对大鼠ASCI后脊髓组织的保护作用
　　1、MTT法检测丹参酮ⅡA最适神经元培养浓度；建立体外脊髓神经元损伤模型；实验分组，Sham组：空白对照组，神经元正常培养；ASCI组：损伤对照组，神经元做损伤模型，神经元正常培养；TⅡA组：制成神经元损伤模型，加含10μM丹参酮ⅡA的神经元培养液培养；MP组：制成神经元损伤模型，加含1μM甲基强的松龙的神经元培养液进行细胞培养；TⅡA+MP组：制成神经元损伤模型，加含10μM丹参酮IIA和0.5μM甲基强的松龙的神经元培养液培养。细胞培养24小时后收集细胞进行分析。24h后Western Blot法检测神经元内Caspase-3、Bcl-2和Bax的表达。
　　2、Allen打击法建立体内大鼠T9节段脊髓急性脊伤模型，根据实验设计，将造模成功的60只SD大鼠分为5组，Sham组：空白对照组，作T9椎板切除，不作急性脊髓损伤打击模型，正常饲养；ASCI组：损伤对照组，作T9椎板切除，并作急性脊髓损伤打击模型，正常饲养；TⅡA组：作T9椎板切除，并作急性脊髓损伤打击模型，给予丹参酮IIA30mg/kg/d药物治疗；MP组：作T9椎板切除，并作急性脊髓损伤打击模型，给予甲基强的松龙30mg/kg药物治疗；TⅡA+MP组：作T9椎板切除，并急性脊髓损伤作打击模型，给予丹参酮IIA30mg/kg/d和甲基强的松龙20mg/kg药物治疗。BBB评分法评估大鼠术后运动功能恢复情况。第1天RT-PCR法检测脊髓组织内Caspase-3 mRNA和NF-κB mRNA的表达， Western Blot法检测各组第1天脊髓组织内NF-κB的表达和第7天脊髓组织内Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达量。第1、7天检测大鼠脊髓组织中SOD活性和MDA的含量，第3天用免疫荧光双标法检测大鼠脊髓组织神经元内Caspase-3的表达量。
　　第三部分丹参酮ⅡA对大鼠ASCI后RhoA/ROCKⅡ/MLC信号通路表达的影响
　　1、大鼠脊髓神经元和星形胶质细胞共培养体系的建立及损伤模型同第二部分，实验分组，Sham组：空白对照组，神经元正常培养；ASCI组：损伤对照组，神经元做损伤模型，神经元正常培养； TⅡA组：制成神经元损伤模型，加含10μM丹参酮 ⅡA的神经元培养液培养；Fasudil组：制成神经元损伤模型，加含10μM法舒地尔的神经元培养液进行细胞培养。细胞培养24小时后收集细胞进行分析。细胞损伤后24h RT-PCR法检测神经元内RhoA mRNA和ROCKII mRNA表达量，Western Blot法检测神经元内RhoA、ROCKⅡ、MLC和p-MLC的表达。
　　2、建立大鼠急性脊髓损伤模型同第二部分，实验分组，Sham组：空白对照组，作T9椎板切除，正常饲养；ASCI组：损伤对照组，作T9椎板切除，并作急性脊髓损伤打击模型，正常饲养。TⅡA组：作T9椎板切除，并作急性脊髓损伤打击模型，给以丹参酮IIA30mg/kg/d药物治疗。Fasudil组：作T9椎板切除，并作急性脊髓损伤打击模型，给予法舒地尔10mg/kg/d药物治疗。根据实验设计，于术后1天和7天各组取4只大鼠处死取材用于检测各项指标。BBB评分法评估大鼠术后运动功能。大鼠ASCI后第1天RT-PCR法检测大鼠脊髓组织内RhoA mRNA和ROCKⅡ mRNA表达水平，术后第1、7天Western Blot法检测RhoA、ROCKⅡ、MLC和p-MLC的表达。
　　结果：
　　第一部分：
　　1.1原代星形胶质细胞接种后4h后显微镜下观察可见部分细胞贴壁，胞体为圆形，透光性强，未见明显的突起伸出。24小时后可见星形胶质细胞贴壁，位于培养瓶的底层，胞体扁平，呈三角形、菱形或者多边形，部分细胞伸出多个粗短的突起，7-9天时可见细胞间相互融合约70％-80%时，可以进行传代；
　　1.2传代的星形胶质细胞贴壁较快，接种后1-2小时大多数细胞已经贴壁，第二天可见胞体变大，形态不规则；传代培养4-5天后细胞贴壁紧密，胞体呈布块状贴壁，相互之间接触。
　　1.3原代脊髓神经元接种后4h后显微镜下观察可见部分细胞贴壁，胞体为圆形，透光性强，未见明显的突起伸出。第二天换液可见多数神经元细胞贴壁。
　　第二部分：2.1损伤后各组大鼠BBB评分均为0分。大鼠脊髓损伤后第1、2天，MP组的SD大鼠BBB评分显著高于TⅡA组（P<0.05），与TⅡA+MP组无显著性差异（P>0.05）。第5至7天，TⅡA组和TⅡA+MP组大鼠BBB运动功能评分高于MP组（P<0.05）。
　　2.2大鼠脊髓损伤后第1天，ASCI组大鼠的脊髓组织内 Caspase-3 mRNA和NF-κB mRNA表达水平明显高于其余各组(P<0.05)。TⅡA+MP组大鼠脊髓内Caspase-3 mRNA和NF-κB mRNA表达水平较MP组无显著升高(P>0.05)。
　　2.3大鼠脊髓损伤后第7天，MP组和TIIA+MP组大鼠脊髓组织内的Bax和Caspase-3表达水平较ASCI组显著降低(P<0.05)，Bcl-2表达水平显著升高(P<0.05)。TⅡA组的 Bcl-2表达量与 ASCI组没有显著差异(P>0.05)，Bax和 Caspase-3表达水平明显下降(P<0.05)。TⅡA组和 MP组大鼠的脊髓组织内的Bax和Caspase-3表达水平较TⅡA+MP组显著升高(P<0.05)，Bcl-2表达水平显著降低(P<0.05)。
　　在脊髓神经元内，ASCI组大鼠脊髓神经元Bax和Caspase-3表达水平较其余各组明显升高(P<0.05)，Bcl-2表达水平显著下降(P<0.05)。MP组神经元内Caspase-3、Bax和Bcl-2表达水平较TⅡA+MP组无显著差异(P>0.05)。TⅡA组脊髓神经元内 Bcl-2表达水平显著低于 TⅡA+MP组(P<0.05)，而两组Caspase-3和Bax的表达水平则无显著差异(P>0.05)。
　　与 ASCI组比较，所有药物治疗组大鼠脊髓组织内和神经元内Bcl-2/Bax明显升高(P<0.05)， TⅡA组大鼠脊髓组织内和神经元内Bcl-2/Bax比值显著低于MP组和TⅡA+MP组(P<0.05)。TⅡA+MP组与MP组Bcl-2/Bax比值无显著性差异(P>0.05)。
　　2.4大鼠脊髓损伤后第1天和第7天，MP组大鼠脊髓组织内SOD含量较ASCI组显著升高（P<0.05），而MDA的含量则显著降低（P<0.05）。TIIA+MP组大鼠脊髓组织内MDA的含量较TIIA组显著降低（P<0.05），而 SOD的含量较 TIIA组无显著差别（P>0.05）。MP组大鼠脊髓组织内SOD和MDA的含量和TIIA+MP组无显著差异（P>0.05）。
　　2.5大鼠脊髓损伤后第1天，ASCI组大鼠脊髓组织内NF-κB的表达水平较其它组显著升高（P<0.05）。TIIA+MP组的脊髓组织内NF-κB水平低于MP组，但无显著性差异(P>0.05)。
　　2.6根据MTT检测结果，选择10μM作为后续实验的最佳的丹参酮IIA浓度来培养神经元。在ASCI组神经元在机械性损伤后24小时OD值较其他组显著下降(P<0.05)。TⅡA+MP组神经元的活力是高于 MP组，但无显著差异(P>0.05)。
　　2.7大鼠脊髓损伤后第3天免疫组织化学实验的结果显示，TⅡA组大鼠脊髓组织内 Caspase-3的表达量较 ASCI组无显著差异（P>0.05），MP组和 TⅡA+MP组脊髓组织内 Caspase-3的表达量较 ASCI组显著降低(P<0.05)，MP组脊髓组织内Caspase-3的表达量较TⅡA+MP组无显著差异（P>0.05）。
　　第三部分：
　　3.1 TⅡA组和Fasudil组的大鼠在各个时间点BBB评分无显著性差异（P>0.05）。第2天至第7天，TⅡA组和Fasudil组大鼠BBB运动功能评分显著高于ASCI组（P<0.05）。
　　3.2 ASCI组脊髓神经元内的RhoA和ROCKⅡ表达水平明显较其它组显著上升(P<0.05)。Fasudil组脊髓神经元内ROCKII表达量较TIIA组大鼠的脊髓组织内的ROCKⅡ表达水平无显著差异(P>0.05)，而RhoA的表达量较TIIA组显著减少(P<0.05)。
　　大鼠脊髓损伤后第1天和第7天， ASCI组大鼠脊髓组织内RhoA和ROCKⅡ的表达水平较其它组显著升高(P<0.05)。大鼠脊髓损伤后第1天， Fasudil组大鼠脊髓组织内 RhoA和 ROCKII表达量较 TⅡA组显著升高（P<0.05）。大鼠脊髓损伤后第7天时，TⅡA组大鼠的脊髓组织内的RhoA和ROCKII表达水平较Fasudil组显著升高（P<0.05）。
　　3.3大鼠脊髓损伤后第1天，ASCI组大鼠脊髓组织内RhoA mRNA和ROCKII mRNA的表达量较其它组显著升高（P<0.05）。Fasudil组RhoA mRNA和ROCKⅡ mRNA的表达量较TIIA组显著降低（P<0.05）。在机械损伤的脊髓神经元内，ASCI组神经元内RhoA mRNA和ROCKⅡ mRNA的表达量较其它组显著升高（P<0.05）。Fasudil组RhoA mRNA和ROCKII mRNA的表达量较TⅡA组低，但无显著性差异（P>0.05）。
　　3.4在脊髓神经元中，ASCI组脊髓神经元内MLC表达量较其它组无显著差异（P>0.05），p-MLC表达量较其它组显著升高（P<0.05）；TIIA组脊髓神经元内p-MLC表达较Fasudil组低，但无显著性差异（P>0.05）；在各组脊髓神经元内，ASCI组脊髓神经元内p-MLC/MLC比值较其它组显著升高（P<0.05）； TIIA组脊髓神经元内 p-MLC/MLC的比值较与Fasudil组显著降低（P<0.05）。
　　大鼠脊髓损伤后第1天， ASCI组大鼠脊髓组织内MLC表达量与其它组无显著差异（P>0.05），p-MLC表达量较其它组显著升高（P<0.05）；TⅡA组大鼠脊髓组织内 p-MLC表达较 Fasudil组低，但无显著性差异（P>0.05）；各组大鼠脊髓组织内， ASCI组大鼠脊髓组织内p-MLC/MLC比值较其它组显著升高（P<0.05）；TⅡA组大鼠脊髓组织内 p-MLC/MLC的比值较Fasudil组低，但无显著性差异（P>0.05）。
　　大鼠脊髓损伤后第7天，ASCI组大鼠脊髓组织内MLC表达量较其它组无显著差异（P>0.05），p-MLC表达量较其它组显著升高（P<0.05）；TIIA组大鼠脊髓组织内p-MLC表达量量较Fasudil组显著升高（P<0.05）。各组大鼠脊髓组织内， ASCI组大鼠脊髓组织内p-MLC/MLC比值较其它组显著升高（P<0.05）；TⅡA组大鼠脊髓组织内p-MLC/MLC比值较Fasudil组显著升高（P<0.05）。
　　结论
　　1.根据免疫组织鉴定结果，我们获得了星形胶质细胞和神经元分层共培养体系，用于进一步的实验研究。
　　2.同甲基强的松龙治疗作用相似，丹参酮ⅡA可以通过其抗氧化、抑制炎性相关因子分泌和抗凋亡等药理作用来发挥对ASCI后脊髓组织保护作用。丹参酮ⅡA联合低剂量甲基强的松龙治疗ASCI能够减少ASCI后甲基强的松龙的使用量，而又能获得类似神经保护作用。
　　3. ASCI后RhoA/ROCKⅡ/MLC信号通路激活，参与抑制轴突再生过程。和法舒地尔作用相似，TⅡA可以能够抑制ASCI后RhoA/ROCKⅡ/MLC信号通路，减少 RhoA、ROCKⅡ的表达，抑制 MLC磷酸化过程，减少p-MLC的形成，促进神经轴突再生和ASCI后脊髓神经功能的恢复。

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封面

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中文摘要

英文摘要

缩略词表

前言

参考文献：

第一部分 大鼠星形胶质细胞和神经元分层共培养体系的建立

1实验试剂及器械

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第二部分 丹参酮IIA联合甲基强的松龙对大鼠ASCI后脊髓的保护作用

1实验试剂及器械

2丹参酮IIA联合甲基强的松龙对大鼠体外神经元机械性损伤后的保护作用研究

3 丹参酮IIA联合甲基强的松龙对大鼠ASCI后脊髓组织的保护作用研究

4 统计学分析

5 结果

6 讨论

第三部分 丹参酮IIA对大鼠ASCI后RhoA/ROCKII/MLC信号通路表达的影响

1实验试剂及器械

2丹参酮IIA对大鼠脊髓神经元机械性损伤后RhoA/ROCKII/MLC信号通路的影响

3 丹参酮IIA对大鼠急性脊髓损伤后脊髓组织内RhoA/ROCKII/MLC信号通路表达的影响

4统计学分析

5 结果

6 讨论

6结论

参考文献

结语

综述: 丹参酮IIA在神经元损伤后保护作用研究进展

附 录(二)

读博期间发表论文及参与学术论著写作情况

致谢