大叶蛇葡萄不同器官黄酮类化合物代谢路径差异表达基因研究

摘要

大叶蛇葡萄（Ampelopsis megalophylla Diels et Gilg）来源于葡萄科蛇葡萄属植物，临床常用于治疗高血压等。现代研究表明，该植物体内含有多种黄酮类活性成分，主要为二氢杨梅素（dihydromyricetin）、杨梅苷（myricitrin）、槲皮苷（quercitrin）和杨梅素（myricetin）等。目前在基因水平上对该植物活性成分的生物合成研究仍然处于空白，不同器官之间活性成分含量差异的分子机制未见报道。本研究采用高通量Illumina测序技术对大叶蛇葡萄的叶、花和果实进行转录组测序，获得了该植物不同器官中丰富的基因功能注释信息，同时基于不同器官之间基因表达量的差异性，探讨相关功能基因在该植物黄酮类化合物生物合成中发挥的作用。具体研究内容及结果如下：
　　(1)采用HPLC技术同时测定了大叶蛇葡萄叶、花和果实中二氢杨梅素、杨梅苷、槲皮苷和杨梅素共4种黄酮类化合物的含量，结果表明不同器官之间各成分含量存在较大差异。其中，二氢杨梅素在叶和花部位中含量相近，但在果实中含量相对较低；杨梅苷在叶中的含量明显高于花和果实；槲皮苷和杨梅素在叶和花中含量均较低，而在果实中均未检测出。
　　(2)采用Illumina测序技术完成了大叶蛇葡萄叶、花和果实3个部位的转录组测序，测序所得原始数据总量超过15 G。所有样本有效数据的Q20均超过94％，Q30均超过89%，通过数据组装共获得了48915条Unigene序列，N50长度达到1648 bp，平均长度为888 bp，总体序列较长，表明测序和组装质量较好。通过与Gene ontology、Pfam、eggnog、KEGG ko、TmHMM、SignalP等多个蛋白质数据库比对，总共有67.28%的序列与已报道的其他物种的基因具有较高同源性，获得了较全面的功能注释信息。通过对KEGG代谢通路中与黄酮类化合物生物合成相关的基因表达量分析，初步筛选获得了不同器官之间与二氢杨梅素、杨梅苷、槲皮苷以及杨梅素生物合成相关的差异表达基因，分别为 FLS（黄酮醇合成酶）、F3',5'H（黄酮类3',5'-羟化酶）、F3OM（黄酮醇3-O-甲基转移酶）、DFR（二氢黄酮醇4-还原酶）和LAR（无色花色素还原酶）。
　　(3)在差异表达基因分析的基础上，结合转录组测序所得的不同器官之间的基因表达量数据，采用实时荧光定量PCR技术对FLS、F3',5'H、F3OM、DFR和LAR共5种酶基因进行基因表达水平检测。实验中筛选出了合适的内参基因，同时验证了转录组测序所得的基因表达量数据的准确性。最后结合分析不同器官之间多种酶基因的表达量与植物体内二氢杨梅素等4种成分的含量变化的相关性，结果表明大叶蛇葡萄叶、花和果实之间二氢杨梅素等4种成分含量的差异主要是由 FLS、F3',5'H、DFR和LAR酶基因通过协同差异表达作用的结果。

目录

声明

英文缩略词表

前言

第一章 大叶蛇葡萄不同器官黄酮类成分的含量分析

1 材料和仪器

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第二章 大叶蛇葡萄转录组测序及差异表达基因分析

1 材料和仪器

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第三章 大叶蛇葡萄体内影响黄酮类成分生物合成的关键酶分析

1 材料与仪器

2 实验方法

3 实验结果

4 讨论

第四章 大叶蛇葡萄黄酮类成分生物合成分子机制的探讨

1 数据材料

2 分析结果

3 讨论

结语与创新

附录

一、附图

二、攻读硕士学位期间已发表论文

文献综述

参考文献

致谢