利胆排毒方对LPS诱导的急性肾损伤小鼠的保护作用机制及其颗粒剂成型工艺研究

摘要

利胆排毒方，是由多种中草药组方而成的一种医院制剂，通过课题组前期实验研究及临床使用证明，具有良好的抗内毒素、抗凝血及提高免疫力等作用。脓毒血症是由感染引起的全身性炎症反应综合征(SIRS)，其导致的急性肾损伤是重症监护室（ICU）患者常见的死亡原因之一，而目前仍未发现对脓毒血症急性肾损伤有着良好治疗效果且毒副作用小的药物。数十年来，抗炎药糖皮质激素（GC）作为脓毒血症的辅助治疗药，其应用剂量等问题的争议一直存在。因此，我们利用脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）诱导脓毒血症急性肾损伤小鼠模型，并给予不同剂量的利胆排毒方预处理小鼠，以地塞米松作为阳性参照，探究利胆排毒方对其的保护作用及可能的作用机制。 目的：确证利胆排毒方对LPS诱导的致死性脓毒血症模型小鼠的生存率保护作用，探究利胆排毒方对LPS诱导的急性肾损伤小鼠的保护作用可能的分子机制，并研究其适宜的临床应用剂型。 方法:采用LPS腹腔注射来制作致死性脓毒血症小鼠模型，将60只Balb/c雄性小鼠随机分为四组：正常组、模型组、利胆排毒方给药组和阳性药地塞米松组，于造模前灌胃给药，造模后48 h内每隔4 h观察小鼠的反应、活动及死亡情况。另将48只Balb/c雄性小鼠随机分为六组，即：正常组、模型组、利胆排毒方低剂量（11.9 g/kg）组、利胆排毒方中剂量（23.8 g/kg）组、利胆排毒方高剂量（47.6 g/kg）组及阳性药地塞米松（5 mg/kg）组。灌胃给药一周后制作脓毒血症急性肾损伤模型：腹腔注射给予LPS，根据文献调查及预实验注射6小时后肾损伤达到高峰时处死小鼠并收集血液及肾脏组织样本。采用HE染色切片法观察LPS对小鼠肾脏组织造成的病理损伤情况；采用酶联免疫法（ELISA）测定小鼠血清及肾组织中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-10的含量；采用荧光定量PCR法检测小鼠肾组织炎性基因TNF-α和IKKβ mRNA的表达情况；采用western blot法对肾组织中NF-κB信号通路相关蛋白IκB、p-IκB及胞浆、胞核中p-NF-κB等的表达情况进行检测；采用激光共聚焦免疫荧光法对核转录因子NF-κB p65蛋白的表达进行检测并进行蛋白表达定位，从而观察利胆排毒方的保护作用对NF-κB信号通路激活的影响，以探讨其可能的作用机制。以颗粒的成型率、吸湿率、溶化率等作为参考指标筛选利胆排毒方制颗粒可用辅料，并以药辅比、辅料配比及乙醇浓度作参考指标筛选最佳制粒工艺，并测量其相对临界湿度。 结果：1.生存率保护实验：各组小鼠造模后均出现行动迟缓、呆滞，不进食不进水，毛发倒翻无光泽，浑身颤抖等现象。各组小鼠生存情况观察发现利胆排毒方干预组48小时的生存率较模型组生存率提高了40%，阳性对照地塞米松组生存率较模型组提高了53.3%，能有效提高致死性脓毒血症小鼠生存率。 2.肾组织的病理损伤：与正常对照组相比，模型组肾组织受到明显损伤，包括肾小管上皮细胞肿胀变性和脱落，刷状缘消失，裸膜可见。利胆排毒方（11.9，23.8，47.6 g/kg）和地塞米松（5 mg/kg）组中肾组织的损伤有明显改善。 3.血清与肾脏炎性因子含量：与正常对照组比较，模型组小鼠血清及肾组织中TNF-α、IL-6、IL-10炎症因子的含量明显上升，利胆排毒方各剂量组（11.9，23.8，47.6 g/kg）和盐酸地塞米松（5 mg/kg）组的炎性因子水平均显著降低（P＜0.01），且呈剂量依赖性抑制。给药组和正常对照组之间没有显著性差异（P＞0.05）。 4.肾组织炎性基因TNF-α和IKKβ mRNA表达：结果表明，较正常对照组，模型组小鼠肾脏的TNF-α和IKKβmRNA表达量明显上调。利胆排毒方各剂量组（11.9，23.8，47.6 g/kg）和地塞米松（5 mg/kg）组TNF-α和IKKβ mRNA表达明显降低。数据显示，LPS可显著上调炎症基因的表达，而利胆排毒方可减少这些基因的表达，且呈剂量依赖性。 5. NF-κB信号通路相关蛋白的表达：结果显示，与模型组比较，利胆排毒方各剂量（11.9，23.8，47.6 g/kg）和地塞米松的预处理显著降低了IκBα蛋白的磷酸化比率（P＜0.01）。此外，较正常组，模型组小鼠肾组织细胞核和细胞质中p-NF-κB p65蛋白显著上调（P＜0.01），在各给药组中明显下调（P＜0.01），且高剂量与中剂量组对小鼠肾组织细胞浆中p-p65蛋白表达量下调的作用相当。 6. NF-κB p65蛋白定位分析：免疫荧光共聚焦显微镜观察结果分析表明，正常对照组肾组织p65含量极少，且主要存在于细胞质中。模型组p65蛋白的表达量显著高于正常对照组，且主要存在于细胞核内。各给药组的细胞核内p65表达量均显著低于模型组。在这些图像中，我们可以看到活化细胞位于肾小管和肾皮质。 7.利胆排毒方颗粒剂制剂工艺：工艺条件为：原料∶微粉硅胶∶甘露醇=1∶0.5∶0.5，采用85%乙醇作为润湿剂。其相对临界湿度为67.8%。 结论：通过生存率保护实验可以证明，利胆排毒方能显著提高致死性脓毒血症小鼠的生存率，具有一定的保护作用。对LPS诱导的小鼠脓毒血症急性肾损伤，利胆排毒方既能抑制抗炎因子TNF-α、IL-6的产生，也能减少促炎因子IL-10的表达量，提示LDP治疗组在LPS诱导的急性肾损伤中具有抗炎作用，并有良好的预后作用。组织学分析也表明利胆排毒方可以减轻肾脏损伤。另外，利胆排毒方还能显著下调肾组织中炎性基因和NF-κB信号通路相关蛋白的表达水平，对NF-κB蛋白转运入核有显著的抑制作用；其抗脓毒血症急性肾损伤的作用与抑制NF-κB信号通路的激活有关。因此，利胆排毒方可以有效减轻LPS引起的急性肾损伤，可能成为中医药治疗急性肾损伤的潜在替代治疗方法。本实验所选用剂型为颗粒剂，工艺简便可行，为利胆排毒方颗粒剂的工业生产提供一定的参考。

目录

声明

缩略词表

前言

第一章利胆排毒方对LPS诱导的致死性脓毒血症小鼠保护作用研究

1. 实验材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第二章利胆排毒方对LPS诱导的急性肾损伤小鼠保护作用机制研究

1 实验材料

2 实验方案

3 实验结果

4. 实验讨论

第三章利胆排毒方颗粒剂研究

1 实验材料

2 实验方法与结果

3 讨论

结语与创新

1 主要研究成果

2 创新

3 展望

参考文献

附录

1 文献综述：细菌内毒素介导的脓毒血症急性肾损伤的研究进展

2 研究生期间发表论文

致谢