肾元颗粒通过Klotho/FGFR1/FGF2信号通路改善高糖诱导肾小管上皮细胞转分化

摘要

糖尿病肾病（DN）是糖尿病（DM）所引起的严重并发症之一，最终可导致终末期肾病（ESRD）甚至死亡，目前尚无特效治疗手段。肾元颗粒是中医针对DN“脾肾亏虚，浊毒内盛”的病机，治当以“温补脾肾、通腑泄浊”立法所创制的湖北省中医院院内制剂，临床研究显示其在延缓DN发生发展方面疗效显著，前期实验研究也初步显示其对DN模型小鼠肾功能具有显著的改善作用。现代研究表明，肾小管上皮细胞转分化（EMT）所引起的肾小管间质纤维化（RIF）在DN发生发展中占有举足轻重的地位，而Klotho(KL)/FGFR1/FGF2信号转导系统与EMT的发生密切相关。因此，本实验在前期研究基础之上从该角度探讨了肾元颗粒对DN的防治机制。 目的： 通过对高糖诱导的人肾小管上皮细胞和链脲佐菌素造模的糖尿病肾病小鼠EMT过程中Klotho/FGFR1/FGF2信号通路变化规律的研究,进一步探讨肾元颗粒通过阻断EMT的进程,达到治疗肾间质纤维化的机理。揭示肾元颗粒治疗糖尿病肾病的作用环节，为中医“温补脾肾，通腑泄浊”法治疗糖尿病肾病提供科学依据。 方法： 一、体外实验 1、含药血清的制备。SPF级Wistar大鼠随机分为空白组、肾元颗粒组及厄贝沙坦组各10只。肾元颗粒组以3.085g/Kg/d剂量灌胃，厄贝沙坦组以0.015g/Kg/d灌胃，空白组每天灌胃等体积蒸馏水。每天灌胃2次，连续7d，在第7天第2次给药lh后经腹主动脉抽血，离心分离血清，过滤灭菌后保存于-20℃冰箱。 2、基于超高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)技术的肾元颗粒大鼠含药血清有效成分的检测。色谱分离条件：ACQUITY UPLCR BEH C18柱（1.7μm,50×2.1mm）；流动相：0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)；梯度洗脱程序为：0～20min，A：90%→40%；20～30min，A：40%→25%；检测波长：203nm；流速：0.5 mL/min；柱温：30℃；进样量为10μL。质谱条件：离子化模式为 ESI(-)，以 MSE采集方式，采集时间为20min，扫描范围100-1200m/z，扫描时间为0.5s。 3、采用CCK-8法检测大鼠血清与10%胎牛血清的等效性，确定大鼠血清培养HK-2细胞的加入浓度；LDH法检测含药血清对HK-2细胞的毒性作用。 4、细胞分组及干预。以高糖（30mmol/L）诱导HK-2细胞建立模型，分为正常组、模型组、高渗对照组、肾元颗粒组、厄贝沙坦组及ERK阻断剂组。各组细胞采用相应干预48h后进行后续指标检测。 5、指标检测。免疫荧光检测KL及FGF2的表达，Western blot及RT-PCR检测KL、成纤维细胞生长因子2(FGF2)、E-钙黏蛋白（E-Cad）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、纤维连接蛋白（FN）、Ⅳ型胶原（CollgenⅣ）蛋白及mRNA表达水平，Western blot分析各组细胞ERK及磷酸化ERK（p-ERK）水平，以免疫共沉淀法检测KL与FGFR1、FGF2与FGFR1免疫复合物。 二、体内实验 1、动物分组及干预。共有120只C57BL/6雄性小鼠被用于实验。随机选取20只作为正常组，其余100只小鼠以链脲佐菌素（STZ）按150㎎·kg-1剂量一次性腹腔注射进行造模。3天后随机检测尾静脉血糖（FBG），选取FBG＞16.7mmol/L的小鼠62只随机分为肾元颗粒组21只，厄贝沙坦组21只及模型组20只。肾元颗粒组以肾元颗粒6.17g/（kg·d）灌胃，厄贝沙坦组以厄贝沙坦分散片0.03g/（kg·d）灌胃，模型组及空白灌以生理盐水2 mL/d，共干预8周。 2、干预期间，根据设定时间点检测空腹血糖、24h尿微量白蛋白。 3、干预结束后处死，眼眶取血测尿素氮及血肌酐，取肾脏以HE、PAS、MASSON染色法行肾脏病理学检测，采用RT-PCR及Western blot法检测肾脏组织中KL、FGF2、E-Cad、α-SMA、FN、CollgenⅣ mRNA及蛋白表达情况，Western blot分析各组细胞ERK及磷酸化ERK水平，以免疫共沉淀法检测KL与FGFR1、FGF2与FGFR1抗体复合物。 结果： 一、体外实验 1、经与对照品保留时间和质谱数据对比，确定大鼠肾元颗粒含药血清中含有淫羊藿苷、黄芪甲苷、大黄素原形化合物的结构，未发现大黄酚及大黄酸。经验证该方法简单，灵敏度高，线性关系、精密度、重复性、回收率均较好。以线性回归方程计算，求得大鼠肾元颗粒含药血清中淫羊藿苷、黄芪甲苷、大黄素的含量分别为0.87μg/mL、0.76μg/mL、13.6μg/mL。 2、CCK-8结果显示，10%、15%、20%空白大鼠血清组增殖率与10%胎牛血清组相比无统计学差异（P＞0.05），故后续分组试验选择20%大鼠血清为实验终浓度。LDH结果显示，与10％胎牛血清组相比，20％空白大鼠血清、20％大鼠肾元颗粒含药血清对细胞LDH活性的影响无统计学差异（P＞0.05），说明含药血清对细胞无毒性作用。 3、与正常组比较，模型组KL、E-Cad蛋白及mRNA表达显著降低（P＜0.05）， FGF2、α-SMA、FN、CollgenⅣ蛋白及mRNA表达显著增高（P＜0.05），p-ERK水平显著增高（P＜0.05）。与模型组比较，肾元颗粒组KL、E-Cad蛋白及mRNA表达显著增高（P＜0.05），FGF2、α-SMA、FN、CollgenⅣ蛋白及mRNA表达显著降低（P＜0.05），p-ERK水平显著降低（P＜0.05）。免疫共沉淀结果显示，正常组存在较多KL与FGFR1的复合物，少量存在FGF2与FGFR1的复合物；与正常组比较，模型组KL与FGFR1的复合物减少（P＜0.05），而FGF2与FGFR1的复合物增多（P＜0.05）。与模型组相比，肾元颗粒组KL与FGFR1免疫复合物均显著增加（P＜0.05），而FGF2与FGFR1免疫复合物显著减少（P＜0.05）。 二、体内实验 与正常组比较，模型组小鼠空腹血糖自造模后3d即持续性升高（P＜0.05），24h尿蛋白定量、血肌酐亦显著性升高（P＜0.05）。KL、E-Cad及KL-FGFR1免疫复合物表达显著性降低（P＜0.05），FGF2、p-ERK、α-SMA、FN、CollgenⅣ、FGF2-FGFR1免疫复合物表达显著性上升（P＜0.05），同时肾脏病理显示模型组小鼠肾小球增生、肥大，部分肾小球萎缩、硬化，肾小球系膜细胞中度以上增生，系膜区增宽，肾小管结构排列较紊乱，部分肾小管萎缩，管腔塌陷，间质有大量淋巴细胞浸润。与模型组比较，肾元颗粒组及厄贝沙坦组空腹血糖无显著性差异（P＞0.05），肾元颗粒组及厄贝沙坦组24h尿蛋白定量显著性降低（P＜0.05），肾元颗粒组血肌酐显著性降低（P＜0.05）。与模型组比较，肾元颗粒组及厄贝沙坦组KL、E-Cad及KL-FGFR1免疫复合物表达均显著性上升（P＜0.05），FGF2、p-ERK、α-SMA、FN、CollgenⅣ、FGF2-FGFR1免疫复合物表达显著性降低（P＜0.05），肾脏病理显示肾元颗粒组及厄贝沙坦组肾小球萎缩、硬化，系膜细胞增生程度较模型组有所减轻，系膜基质轻度增宽，肾小管病变较模型组有不同程度减轻，间质有少量淋巴细胞浸润。 结论： 1、肾元颗粒大鼠含药血清中主要药效成分为淫羊藿苷、黄芪甲苷及大黄素，这为该制剂的进一步药理机制研究提供了参考。 2、肾元颗粒含药血清能通过上调高糖诱导的HK-2细胞KL的表达，调控FGFR1/FGF2/ERK信号转导途径从而改善肾小管上皮细胞EMT，这可能是其防治糖尿病肾病的机制之一。 3、肾元颗粒对DN小鼠肾小管上皮细胞转分化具有明确的改善作用，其机制可能为通过调节KL/FGFR1/FGF2信号转导途径实现的。

目录

声明

缩略词表

前言

第一部分 体外实验

引言

实验一 基于UPLC-MS/MS技术的肾元颗粒含药血清有效成分的测定

实验二 肾元颗粒含药血清对高糖诱导人肾小管上皮细胞转分化的保护作用及机制研究

参考文献

附 录 1

第二部分 体内实验肾元颗粒对糖尿病肾病小鼠肾小管上皮细胞转分化的保护作用及机制研究

引言

1材料与方法

2结果

3讨论

参考文献

附 录 2

结语

文献综述1:糖尿病肾病中医病名及病因病机探析

文献综述2:Klotho基因与肾脏纤维化

攻读学位期间参与课题和发表论文情况

致谢