虎掌南星对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及其物质基础研究

摘要

虎掌南星Rhizoma Pinelliae Pedatisectae（RPP）为天南星科（Araceae）半夏属（Pinellia）掌叶半夏Pinellia pedatisecta Schott的干燥块茎。具有燥湿化痰、消肿散结、祛风止痉的功效，临床用于治疗顽痰咳嗽、眩晕、中风、口眼歪斜、癫痫、惊风等。 临床上广泛运用单味药天南星及其复方治疗中风，其中主治卒中的古方“三生饮”君药即是天南星，现代药理研究亦证明该方能增加大耳兔的脑血流量及降低脑耗氧量，通过提高大鼠Bcl-2基因表达来减少梗死区域体积，从而表现出对脑缺血再灌注损伤的保护作用。报道亦进行了拆方研究，去掉方中的天南星之后，发现处方显著降低脑血流量。 根据药典和各地方标准，天南星和虎掌南星分别来源于同科不同属植物并且为不同的药材。但是，据我们的调查，虎掌南星在现代一个相当时期内是医药市场天南星的主要来源和主流商品。虎掌南星强于“化痰”之功，同时中医理论有“中风治痰”的记载。宋·苏颂《本草图经》中载“古方多用虎掌，不言天南星……中风痰毒方中多用之。”古代本草首次记载治疗中风痰毒的药物即为虎掌。明清两代记载治疗中风的中药频次，以天南星用药记载居首。临床遣方组药上，RPP常用于治疗中风等神经系统相关疾病的组方。但尚缺乏动物试验证明其功效，其作用机制亦尚未完全阐明。基于以上，本课题旨在探讨RPP粗提物对经典“卒中”模型（大鼠脑缺血再灌注诱导神经损伤）的保护作用，同时探讨其可能的作用机制。借助仪器联用技术分析其有效部位的化学成分。 在本草研究部分，论文考证了RPP的名称、原植物及其产地。RPP历史称谓混乱，多以称谓“虎掌”、“天南星”居多。明清之后，本草更多将虎掌称为天南星，失于偏颇。RPP是早期本草中记载天南星的主要品种。从本草的植物形态描述或附图看，古代“RPP”来源亦存在多种记载，更多记载为今之掌叶半夏，并且宋代已经开始记载其种植。RPP古产地的考证与现代基本一致，道地药材出自今山东、河北。论文亦追踪RPP的研究进展。化学成分上，文献较多报道其含有的生物碱、有机酸、凝聚素。药理作用上，镇静、抗惊厥、祛痰、抗氧化，以及抗凝聚的功效报道较多。文献考证为后续的研究提供了支撑。 通过系统溶剂法（利用不同溶剂的极性梯度）来萃取RPP醇提取物的水混悬液得到不同极性的部位群。即：石油醚部位（A）、氯仿部位（B）、乙酸乙酯部位（C）、正丁醇（水饱和）部位（D）和残余水部位（E）的提取物。通过MTT比色法筛选RPP对神经细胞保护作用的有效部位，其中正丁醇部位拮抗H2O2致神经细胞损伤作用最为显著。 整体动物水平实验通过经典中脑动脉闭塞（MCAO）建立大鼠脑缺血模型，缺血2小时，随后24小时再灌注。在诱导局部脑缺血前，大鼠口服给予不同剂量的RPP正丁醇提取物（n-butyl alcohol extracts, NBES）或同体积盐水一周。再灌注后用Longa法检测大鼠神经缺陷评分，取脑组织用TTC染色法测定脑梗死体积，采用末端脱氧核苷酸转移酶介导dUTP切口末端标记（TUNEL）法测定神经细胞凋亡。为验证NBES抗大鼠脑缺血/再灌注损伤与氧化应激、炎症反应的关系，黄嘌呤氧化酶法测定 SOD活性；硫代巴比妥酸（Thibabituric Acid, TBA）法测定MDA含量；放射免疫测定炎症反应相关因子TNF-α和IL-1β的水平。为验证NBES抗大鼠脑缺血/再灌注损伤的作用与凋亡相关基因表达的关系，蛋白质免疫印迹（western blot,WB）法检测凋亡相关因子B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）、Bcl-2相关 X（Bax）蛋白表达。结果显示 NBES在大鼠体内能明显减轻神经功能缺损并减少其体内梗死体积。NBES对大鼠脑缺血/再灌注保护作用与大鼠体内超氧化物歧化酶（SOD）活性增加和丙二醛（MDA），肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）水平降低有关。同时 NBES预处理能抑制缺血诱导的神经元凋亡，并且蛋白免疫印迹（WB）显示NBES上调Bcl-2和下调Bax表达。NBES通过减轻神经元氧化损伤，降低炎症反应而抑制神经元凋亡，明显改善大鼠脑I/R损伤。 采用液-质联用（HPLC-UV-MS）技术对RPP有效部位（正丁醇萃取部位）的化学成分进行分析，以探究RPP对大鼠脑缺血/再灌注损伤保护作用的物质基础。以部分核苷类成分标准品作为对照，HPLC-UV-MS确认其中含有腺苷、腺嘌呤、尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、鸟苷；同时检测出尿苷、肌苷、黄嘌呤苷等核苷类成分及柠檬酸、酪氨酸、酪氨酸葡萄糖、苯丙氨酸等有机酸类成分。同时，为进一步分析和验证相关化学成分，实验采用NMR分析正丁醇萃取部位化学成分组成。提取物部位成分复杂，一维NMR谱虽能提供丰度的信息，但因信号重叠严重而影响结构分析，结合二维谱能较好得到一些化合物信息。结果显示NBES的1H-NMR谱、1H-1H COSY谱和1H-13C HSQC谱呈现核苷类成分特征化学位移区间和有机酸的特征峰，进一步确证了NBES中存在核苷类及有机酸类成分，推测出可能存在乳酸、丙氨酸、乙酸、缬氨酸、苹果酸、延胡索酸共6种有机酸类成分。 论文路线：对RPP的本草考证→系统溶剂法提取虎掌南星不同极性部位→MTT比色法筛选有效部位→NBES对大鼠脑缺血再灌注作用及机制研究→HPLC-MS/NMR分析NBES部位化学成分。 论文研究阐释了虎掌南星的传统功效，同时分析其有效部位的化学成分。论文研究为其临床运用和未来可能的新药开发提供了一定的理论基础。亦为扩大天南星的药用资源提供了一定的参考。

目录

声明

英文缩略图

1 虎掌南星的本草研究及其现代研究进展

1.1 虎掌南星的本草研究

1.2 虎掌南星的研究进展

1.3 立题背景及实验路线

2 虎掌南星有效部位的筛选研究

2.1 虎掌南星不同极性部位的提取

2.2 虎掌南星有效部位的筛选

2.3 本部分研究小结

3 虎掌南星NBES部位对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用

3.1 NBES抗I/R诱导的大鼠脑损伤的作用

3.2 NBES抗大鼠脑缺血/再灌注损伤的作用与氧化应激、炎症反应的关系

3.3 NBES抗大鼠脑缺血/再灌注损伤的作用与凋亡相关基因表达的关系

3.4 本部分研究小结

4 虎掌南星有效部位化学成分的分析

4.1 虎掌南星有效部位（NBES）化学成分HPLC-UV-MS 分析

4.2 虎掌南星有效部位（NBES）化学成分NMR分析

4.3 本部分研究小结

5 文献研究

5.1 中医药对中风的认识及天南星科化痰药治疗中风的探讨

5.2 脑缺血再灌注损伤机制及其治疗的研究进展

论文结语

论文创新点为：

参考文献

期间学术成果

致谢