生防菌株HD-087高产菌株的选育与发酵条件的研究

摘要

农用抗生素作为生物农药的主体，因其具有低毒高效、选择性强、残留时间短、无三致(致癌、致畸、致突变)和无公害等优点，正日益受到世界各国的重视。 放线菌HD-087是一株对小麦赤霉以及其它多种植物病原真菌有拮抗作用的野生型菌株，本研究以HD-087为研究对象，利用诱变育种与基因组改组技术选育高产菌株并进行了发酵条件的优化。 首先对该菌株进行了紫外线、微波、亚硝酸钠诱变处理，获得了基因组改组的出发菌株，即UV-13、UV-20、MW-4、MW-25、N-3、N-16，这些菌株的抑菌圈直径与HD-087相比分别提高了15.54％、14％、16.92％、23.53％、23.35％、20％。 对原生质体制备条件进行了优化，得到最优条件：菌丝体培养96h，甘氨酸0.6％，溶菌酶4mg/mL，32℃酶解1h。原生质体经紫外线灭活150s；热灭活60min后融合，经过三轮改组得到高产菌株HD-087-18，其抑菌圈直径比HD-087提高了77％，并具有良好的遗传稳定性。 培养特征观察表明，HD-087-18的菌丝体形态，菌落形态和颜色与HD-087相比有一定的改变。萃取试验表明该菌株的产物为极性水溶性抗生素。100℃10min可失活；在pH3-9和光照条件下稳定性良好；8倍稀释后无抑菌效果；54℃保存15天活性稳定。 通过单因子及正交实验得到HD-087-18的发酵培养基优化配方为：淀粉1％、黄豆面0.8％、酵母粉0.12％、CaCO<,3>0.4％。最佳发酵条件为：培养基起始pH6，250mL三角瓶中装液量40mL，种龄48h，接种量为2.5％，180r/min、28℃、培养5d。

目录

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第1章绪论

1.1诱变育种在抗生素生产中的应用

1.2原生质体融合技术在抗生素生产中的应用

1.3基因工程在抗生素生产中的应用

1.4 DNA改组与基因组改组技术在抗生素生产中的应用

1.5农用抗生素菌种选育发展趋势

1.6本课题的立论依据

第2章材料与方法

2.1试验材料

2.1.1供试菌株

2.1.2主要培养基

2.1.3试剂

2.1.4试验器材

2.2试验方法

2.2.1拮抗菌株的摇瓶发酵筛选与抑菌谱的测定

2.2.2HD-087菌株的诱变选育

2.2.3基因组改组选育高产菌株

2.2.4高产菌株与HD-087培养特征的对比考察

2.2.5发酵液性质研究

2.2.6高产菌株发酵条件的研究

第3章结果与分析

3.1拮抗菌株的摇瓶发酵筛选与抑菌谱测定

3.1.1拮抗菌株的摇瓶发酵筛选

3.1.2抑菌谱测定

3.2HD-087菌株的诱变选育

3.2.1孢子悬浮液的制备

3.2.2紫外诱变

3.2.3微波诱变

3.2.4NaNO2诱变

3.2.5三种诱变剂诱变效应的对比分析

3.3基因组改组选育高产菌株

3.3.1基因组改组亲本菌株的确定

3.3.2原生质体制备

3.3.3原生质体再生

3.3.4原生质体融合

3.3.5基因组改组与融合子的筛选

3.4高产菌株与HD-087培养特征的对比考察

3.4.1菌丝形态观察对比结果

3.4.2菌落形态对比结果

3.4.3固体培养特征对比结果

3.4.4发酵培养特征对比观察

3.5发酵液性质研究

3.5.1发酵液的预处理

3.5.2溶媒萃取试验

3.5.3发酵液稳定性试验

3.6发酵条件的研究

3.6.1单因子对菌株产抗生素的影响

3.6.2正交试验优化发酵培养基

3.6.3培养条件对菌株产抗生素的影响

第4章结论与讨论

4.1菌株HD-087筛选与抑菌谱测定

4.2菌株HD-087的诱变育种

4.3菌株HD-087基因组重排育种

4.4高产菌株培养特征的考察

4.5发酵液性质的研究

4.6发酵条件的研究

4.7工作设想

参考文献

致谢