甜菜M14品系特异表达基因M14-263在模式植物中的表达研究

摘要

甜菜M14品系是由栽培甜菜(Beta uvlgaris L.)与四倍体白花甜菜(Beta corolliflora Zoss.)种间杂交，进一步回交获得的甜菜无融合生殖单体附加系。甜菜M14品系染色体组除了含有18条栽培甜菜染色体外，还附加有一条白花甜菜第9号染色体，附加染色体的传递率高达96.5％。研究甜菜M14品系中的特异表达基因，能够为解释甜菜M14品系特殊的生殖方式提供直接的分子生物学证据，从而使我们对甜菜M14品系优良性状的研究具有更高的价值和意义。 实验室前期工作中，以栽培甜菜为对照，已从甜菜M14品系中得到298个特异的ESTS，并已全部进行了测序和生物信息学分析；同时利用RACE技术从甜菜M14品系的298个ESTs中得到了甜菜M14品系9个特异表达基因的cDNA全长，本实验研究的M14-263基因是其中之一。对M14-263基因的生物信息学分析结果显示：M14-263基因cDNA与不同物种的Rab类小GTP结合蛋白基因的核酸序列同源性较高；M14-263基因编码的蛋白与不同植物中的Rab类小GTP结合蛋白也都有较高的相似性。作为分子开关的Rab蛋白家族与植物的生长发育密切相关。 本实验将M14-263基因的cDNA全长片段转入模式植物，研究M14-263基因在分子生物学方面的表达模式与转基因植株表型性状间的关系以及转基因植株的蛋白的差异表达情况，进而推测．M14-263基因的功能特性。实验中利用表达载体pBI121与M14-263基因构建了植物表达载体pBI-M14-263，并将其导入根癌农杆菌EHA105中。利用农杆菌转化系统，将携带有pBI-M14-263的农杆菌分别利用叶盘法和花头浸泡法转入模式植物烟草及拟南芥中，获得转基因植株。经基因组DNA的PCR、Southem 印迹、RT-PCR、Northem印迹等分子生物学检测及GUS组织化学染色检测后表明，M14-263基因已转入模式植物中，并且在转基因植株的花、茎、叶中均有表达。 对转M14-263基因植株的形态学观察结果显示：M14-263基因的转入导致T0代转M14-263基因烟草植株出现向地性生长现象明显、分枝增多、顶端优势受到抑制、植株孱弱矮小、花序减少、花在生长过程中易脱落、育性降低等异常的表型变化：而T0代转M14-263基因拟南芥植株则出现孱弱矮小、结实率降低且死亡一率显著上升等异常的表型变化。对转M14-263基因烟草植株和未转基因烟草对照植株的叶片进行蛋白质双向共发现显著差异表达蛋白点29个，这些差异表达蛋白包括表达消失的蛋白点、新表达的蛋白点、表达程度减弱的蛋白点及表达程度增强的蛋白点。其中21号蛋白质点在转M14-263基因烟草植株中特异表达，而在未转基因烟草中为缺失，该蛋白质点分子量大小约为23kD，且等电点在5.9附近，与预测的M14-263蛋白的分子量和等电点理论值相符。 实验结果表明：甜菜M14品系特异表达基因M14—263编码的蛋白具有与Rab类蛋白相似的功能，在植物的生长发育特别是细胞分裂分化以及生殖发育中发挥着重要的作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章前言

1.1无融合生殖现象

1.2甜菜M14品系无融合生殖材料及研究进展

1.3甜菜M14品系特异表达基因M14-263

1.4小GTP结合蛋白

1.4.1小GTP结合蛋白的种类及功能

1.4.2 小GTP结合蛋白的结构及其调节方式

1.4.3 Rab蛋白

1.5基因工程中的农杆菌转化系统概述

1.5.1农杆菌转化系统的原理

1.5.2植物基因工程中的表达载体pBI121

1.5.3农杆菌转化系统的优点及局限性

1.6蛋白质双向电泳技术

1.7本实验的内容及目的

1.8本实验的技术路线

第2章材料与方法

2.1实验材料

2.1.1植物材料

2.1.2菌株及质粒载体

2.1.3各种试剂及试剂盒

2.1.4实验所需常用溶液、试剂及培养基的配制

2.1.5实验所需引物及M14-263基因cDNA全长序列

2.2实验方法

2.2.1甜菜M14品系特异表达基因M14-263 cDNA全长的获得

2.2.2植物表达载体pBI-M14-263的构建

2.2.3连接产物转化大肠杆菌DH5α及阳性克隆子的筛选与鉴定

2.2.4植物表达载体pBI-M14-263导入根癌农杆菌

2.2.5根癌农杆菌介导的模式植物的遗传转化

2.2.6转基因再生植株的分子生物学检测

2.2.7转基因再生植株的组织化学检测

2.2.8转基因再生植株的形态学观察及表型分析

2.2.9转M14-263基因烟草与未转基因烟草植株的蛋白质双向电泳

第3章结果与分析

3.1甜菜M14品系特异表达基因M14-263 cDNA全长的获得

3.1.1甜菜M14品系花器总RNA的提取

3.1.2 cDNA第一链的合成

3.1.3 M14-263基因cDNA全长的扩增

3.1.4 M14-263基因在野生型烟草及拟南芥中的扩增

3.2植物表达载体pBI-M14-263的构建

3.2.1质粒载体pBI121的制备

3.2.2质粒载体pBI121的酶切反应

3.2.3 M14-263基因的酶切反应

3.3大肠杆菌DH5α阳性克隆子的筛选与鉴定

3.4植物表达载体pBI-M14-263导入根癌农杆菌

3.4.1电击法转化根癌农杆菌EHA105

3.4.2农杆菌阳性克隆子的筛选与鉴定

3.5根癌农杆菌介导的模式植物的遗传转化

3.5.1烟草遗传转化体系的优化

3.5.2叶盘法转化烟草植株

3.5.3花头浸泡法转化拟南芥

3.6烟草转基因再生植株的分子生物学检测

3.6.1 M14-263基因在转基因烟草基因组DNA中的PCR检测

3.6.2 Southern印迹

3 6.3 M14-263基因在转基因烟草花、茎、叶中的RT-PCR检测

3.6.4 Northern印迹

3.7烟草转基因再生植株的组织化学检测

3.8拟南芥转基因T0代植株的分子生物学检测

3.8.1拟南芥转基因植株T0代转基因植株的获得

3.8.2 T0代拟南芥转基因植株基因组DNA中的PCR检测

3.8.3 T0代拟南芥的RT-PCR检测

3.9转基因再生植株的形态学观察及表型分析

3.9.1 T0代烟草转基因植株

3.9.2 T0代拟南芥转基因植株

3.10转M14-263基因烟草与未转基因烟草叶片的蛋白质双向电泳

第4章讨论

4.1 M14-263基因在转基因植株体内的作用

4.1.1 M14-263基因对转基因植株株型的影响

4.1.2 M14-263基因对转基因植株花序的影响

4.1.3 M14-263基因对转基因植株果实的影响

4.2叶盘法和花头浸泡法转化效果的比较

4.3外源基因在转基因植株中的表达情况及稳定性

4.4转M14-263基因烟草与未转基因烟草中差异表达蛋白的分析

4.5下一步实验设想

第5章结论

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表的学术论文