甜菜谷氨酰胺合成酶基因启动子的克隆

摘要

在植物的生长发育过程中，氮素的同化是一个十分重要的生理过程。其中，无机氮必须同化为有机氮才能为植物体所吸收和利用。谷氨酰胺合成酶(GS)是参与这一同化过程的关键酶。 启动子是DNA链上可以与RNA聚合酶特异结合的部位。启动子活性分析是一种非常重要的研究相关基因功能和时空特性性表达特征的手段。 本实验的目的是从甜菜中克隆GS基因启动子片段。以甜菜叶片为材料，提取其基因组DNA为模板。根据已知区域设计特异性引物，进行PCR扩增。将PCR产物克隆到T载体中，转化大肠杆菌感受态细胞，然后测序。此实验利用LA-PCR克隆得到了甜菜谷氨酰胺合成酶基因的起始密码子上游的828bp启动子序列。利用在线生物信息学软件TSSP和PLACE分析该序列，分析结果表明甜菜谷氨酰胺合成酶基因启动子区TATA—BOX位于起始位点上游的25—30区段，该序列包含有36个可能的顺式作用元件。 本实验分离GS基因的调控区，GS基因的表达调控研究及实现甜菜高同化氨途径奠定了分子生物学基础。

目录

文摘

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声明

第1章绪论

1.1课题背景

1.2启动子的概念、结构特征及一般特点

1.2.1启动子的概念

1.2.2启动字的结构特征

1.2.3启动子的一般特点

1.3启动子的分类

1.3.1启动子的分类

1.3.2组成型、组织特异型和诱导型启动子

1.4启动子的克隆方法

1.4.1利用基因组文库筛选启动子

1.4.2利用启动子探针载体筛选启动子

1.4.3利用启动子捕获方法分离和鉴别启动子

1.4.4利用常规PCR技术克隆启动子

1.4.5以PCR技术为基础的技术克隆启动子

1.5本课题的目的和意义

第2章实验材料和实验设计思路

2.1实验材料

2.1.1甜菜材料，菌株

2.1.2主要实验用仪器

2.1.3各种酶制剂及试剂盒

2.1.4各种溶液配制

2.1.5实验用引物

2.2实验设计思路

第3章实验中引物的设计

3.1引物设计的原则和技巧

3.2本实验的引物设计标准

第4章甜菜GS基因启动子的克隆

4.1甜菜基因组DNA的提取及检测

4.1.1基因组DNA的提取流程

4.1.2基因组DNA的电泳检测

4.1.3基因组DNA的浓度测定及调整

4.2 DNA的限制酶酶切

4.2.1 DNA酶切反应体系

4.2.2连接反应

4.3目的DNA片段的获得

4.3.1 500bp目的DNA片段的获得

4.3.2 400bp目的DNA片段的获得

4.4 PCR产物的回收

4.5 DNA片段的连接反应

4.6 DNA片段的转化

4.6.1感受态细胞的制备(Cacl2法制备新鲜大肠杆菌感受态细胞DH5a)

4.6.2转化反应

4.7阳性重组子的筛选及鉴定

4.7.1阳性重组子的蓝白筛选

4.7.2阳性重组子的PCR验证

4.7.3测序

第5章测序结果与启动子分析

5.1甜菜谷氨酰胺合成酶基因启动子的测序结果

5.2甜菜谷氨酰胺合成酶基因启动子的序列分析

结论

参考文献

附 录

致谢