流行性乙型脑炎病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立

摘要

流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis，JE)是由乙型脑炎病毒(Japaneseencephalitis virus，JEV)引起的严重的人畜共患病，对人类健康和畜牧业生产危害巨大。目前，乙型脑炎病毒的检测方法有病毒分离鉴定、免疫学检测、分子生物学检测等。这些检测方法虽然为乙型脑炎的诊断提供了强大的技术支持，但存在着耗时长，费用高等缺点。环介导等温扩增法(Loop-mediated isothermalamplification，LAMP)是一种新型的分子生物学检测技术，若能利用该技术检测流行性乙型脑炎病毒可以克服以上缺点。
　　 本研究根据JEV基因序列设计了3对特异性引物，采用LAMP方法对流行性乙型脑炎病毒核酸进行等温扩增，建立优化了两步法和一步法两种检测方法。两步法LAMP检测体系中含有0.2μM F3、B3，2μM FIP、BIP，0.8μM FLP、BLP，0.4 mM dNTP，20 mM Tris-HCl(pH8.8)，10 mM KCl，10 mM(NH4)2SO4，6 mMMg2+，0.1％Triton X-100，1.1 mM Betaine，8U BST聚合酶，于65℃水浴锅中放置60min。一步法RT-LAMP检测体系中0.2μM F3、B3，2μM FIP、BIP，0.8μM FLP、BLP，0.8 mM dNTPs，20 mM Tris-HCl(pH8.8)，10 mM KCl，10 mM(NH4)2SO4，6 mM Mg2+，0.1％Triton X-100，1.1 mM Betaine，8 U BST聚合酶，1 U AMV反转录酶，于65℃水浴锅中放置70min即可完成反应。两种检测方法均可在扩增产物中加入SYBR Green I染料，直接或在紫外光下观察颜色变化判定结果。试验表明LAMP方法比RT-PCR灵敏度高10倍，并具有较高的特异性，对猪细小病毒、猪小环状病毒、伪狂犬病毒、猪瘟病毒等类似病毒均无交叉反应。且LAMP试剂在-20℃下具有良好的稳定性。

目录

文摘

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声明

第1章 绪论

1.1流行性乙型脑炎

1.1.1 流行性乙型脑炎病毒的病原学及分子生物学特性

1.1.2乙型脑炎流行病学

1.1.3乙型脑炎致病机制

1.1.4乙型脑炎检测方法研究进展

1.2环介导等温扩增(LAMP)

1.2.1LAMP的原理

1.2.2 LAMP的特点

1.2.3 LAMP的应用

1.3本研究意义

1.4技术路线

第2章 流行性乙脑病毒两步法LAMP检测方法的建立

2.1 材料

2.1.1病毒及细胞

2.1.2相关试剂

2.2方法

2.2.1 引物设计

2.2.2 cDNA的合成

2.2.3 LAMP检测方法的建立及优化

2.2.4 LAMP扩增产物的可视化检测

2.2.5 LAMP检测方法的灵敏度检测

2.2.6 LAMP检测方法的特异性检测

2.3结果

2.3.1 cDNA的PCR鉴定结果

2.3.2 LAMP检测方法的建立及优化结果

2.3.3 LAMP扩增产物的可视化检测结果

2.3.4 LAMP检测方法灵敏度的检测结果

2.3.5 LAMP检测方法特异性的检测结果

2.4讨论

2.4.1 LAMP引物的设计

2.4.2 LAMP方法的影响因素

2.5 小结

第3章 流行性乙脑病毒一步法RT-LAMP检测方法的建立

3.1 材料

3.1.1病毒及细胞

3.1.2相关试剂

3.2方法

3.2.1 引物设计

3.2.2病毒RNA的提取

3.2.3引物配比浓度的优化

3.2.4 RT-LAMP检测方法的建立及优化

3.2.5 RT-LAMP扩增产物的可视化检测

3.2.6 RT-LAMP检测方法的灵敏度检测

3.2.7 RT-LAMP检测方法的特异性检测

3.2.8临床样品的检测

3.2.9 LAMP检测试剂稳定性的检测

3.3 结果

3.3.1 引物配比浓度的优化结果

3.3.2 RT-LAMP检测方法的建立及优化结果

3.3.3 RT-LAMP扩增产物的可视化检测结果

3.3.4 RT-LAMP检测方法的灵敏度检测结果

3.3.5 RT-LAMP检测方法的特异性检测结果

3.3.6 LAMP检测临床样品的结果

3.3.7 LAMP检测试剂稳定性的检测结果

3.4讨论

3.4.1 RT-LAMP方法的影响因素

3.4.2 RT-LAMP方法存在的问题

3.5 小结

结论

参考文献

致谢

攻读学位期间研究成果