盐胁迫下甜菜M14品系根部膜的比较蛋白质组学研究

摘要

盐胁迫是世界上影响植物生长、发育和产量的主要非生物胁迫之一。同时甜菜是双子叶藜科植物，有很高的经济价值。甜菜是一种抗盐作物，能在高盐条件下生存，是研究植物抗盐的绝好材料。甜菜M14品系是由栽培甜菜和野生白花甜菜杂交产生的，它含有栽培甜菜基因组和野生白花甜菜第9号染色体。研究证实甜菜M14品系保留了一些野生白花甜菜的优良特性，例如:抗盐性和无融合生殖等。植物细胞中有许多专门的执行特定功能的膜系统，包括质膜蛋白和各种细胞器结合的膜蛋白，膜蛋白作为植物细胞与外界环境物质交换和通信的接口，控制许多主要的细胞功能，如代谢产物，离子转运，囊泡运输等，盐胁迫下最先受到伤害的部位为膜，膜蛋白在植物抵御盐胁迫过程中起到至关重要的作用，膜蛋白的改变引起细胞形态的变化。因此，研究盐胁迫下膜蛋白抗盐机制有重要意义。
　　本实验室前期已对甜菜M14品系叶片差异表达膜蛋白质进行分析。因此，本试验将利用iTRAQ技术对不同浓度NaCl(0、200、400mM)胁迫下甜菜M14品系根部膜蛋白质进行定量蛋白质组学分析，利用Proteome Discoverer软件将质谱信息与甜菜数据库信息进行比对搜索。对p＜0.05的蛋白质进行分析，阈值大于2.0或者小于0.5的蛋白质定义为盐胁迫下甜菜M14品系根部差异膜蛋白质，同时分别作为上调和下调蛋白质的评判标准，得到73个差异表达蛋白质。为了进一步研究盐应答膜蛋白，将根部盐应答膜蛋白进行分类，分别是:运输(32％)、参与多种生物进程(10％)、信号转导(10％)、胁迫和防御(8％)、能量(8％)、降解(6％)、转录(6％)、代谢(5％)、合成(3％)、细胞结构(1％)和未知(11％)。结果表明，参与运输、信号转导和多种生物进程相关蛋白占较大比例。通过生物信息学分析发现鉴定的膜蛋白质多数定位在液泡膜、核膜、质膜、线粒体膜上。这些结果表明膜蛋白能够感知盐胁迫信号，传递信号，调节膜流动性及透性，调动各个细胞器膜蛋白共同作用抵抗盐份的侵害，建立新的平衡，本研究为进一步理解甜菜的抗盐机制奠定基础。

目录

摘要

第1章 前言

1．1 甜菜M14品系

1．2 盐胁迫及其对植物的影响

1．3 膜蛋白质组学概述

1．3．1 膜蛋白介绍

1．3．2 盐胁迫对植物细胞生物膜的影响

1．3．3 盐胁迫下膜蛋白组学的研究进展

1．3．4 植物膜蛋白质组学研究的难点

1．3．5 定量蛋白质组学技术——同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术

1．4 本研究的目的及意义

1．5 本研究的技术路线

第2章 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 主要试剂及试剂盒

2．1．3 主要试验仪器

2．1．4 试验所需主要溶液及试剂的配制

2．2 试验方法

2．2．1 植物材料的获得

2．2．2 盐胁迫相关生理生化指标的测定

2．2．3 根部膜蛋白质的提取

2．2．4 蛋白质的定量

2．2．5 膜蛋白的鉴定

2．2．6 蛋白质样品还原、烷基化和胰蛋白酶酶解

2．2．7 iTRAQ标记及检测

2．2．8 强阳离子交换分离(SCX，strong cation exchange)

2．2．9 质谱鉴定

2．2．10 蛋白质定量定性分析软件设置

2．2．11 iTRAQ数据定量分析及差异表达蛋白质的筛选

2．2．12 差异表达蛋白的功能分类及生物信息学分析

2．2．13 根部差异表达膜蛋白响应盐胁迫的代谢网络图谱的绘制

2．2．14 部分差异表达膜蛋白质编码基因的RT-PCR验证

第3章 结果与分析

3．1 不同盐浓度处理下甜菜M14品系相关生理生化指标

3．1．1 不同盐浓度处理下甜菜M14品系形态学指标

3．1．2 盐胁迫下甜菜M14品系根部生物量变化

3．1．3 盐胁迫下甜菜M14品系根长变化

3．1．4 盐胁迫下甜菜M14品系根部相对含水量变化

3．1．5 盐胁迫下甜菜M14品系根部膜透性变化

3．1．6 盐胁迫下甜菜M14品系根部SOD酶活力变化

3．2 蛋白质的定量分析

3．3 膜蛋白检验

3．4 盐胁迫下甜菜M14品系根部膜蛋白质的鉴定及定量分析

3．5 根部盐应答膜蛋白亚细胞定位预测及功能分类

3．6 部分差异表达膜蛋白质编码基因的RT-PCR验证

3．7 根部差异表达膜蛋白响应盐胁迫的代谢网络图谱

第4章 讨论

4．1 盐胁迫对植物生理生化进程的影响

4．2 根部应答盐胁迫的膜蛋白质

4．2．1 运输相关蛋白质

4．2．2 代谢相关蛋白质

4．2．3 信号转导相关蛋白质

4．2．4 能量相关蛋白质

4．3 甜菜M14品系根部、叶片差异表达膜蛋白质比较分析

4．4 差异表达膜蛋白质基因水平与蛋白质水平趋势不一致性分析

4．5 根部应答盐胁迫的膜蛋白质抗盐机制潜在模型

4．6 根部差异表达膜蛋白响应盐胁迫的代谢网络图谱

结论

参考文献

附录

致谢

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