转Bt基因抗虫早粳稻品系目的基因整合及其表达

摘要

水稻(Oryza sativa)是我国重要的粮食和经济作物，也是东北地区三大主要农作物之一。我国有65％以上的人口以稻米为主食，稻米的生产安全关乎国计民生。现今虫害对稻米的生产安全构成了严重的威胁，每年水稻因虫害造成的经济损失高达115亿元。传统农业生产对害虫的防治主要依赖于化学试剂，但化学试剂的长期大量使用不仅浪费人力、物力和财力，还会造成环境污染、害虫再猖獗等问题。因此，培育抗虫水稻至关重要。目前，水稻转基因技术已经趋于成熟并培育出多种具有抗虫作用的转Bt基因水稻。
　　本研究以转Bt基因抗虫早粳稻空育131和超级稻松粳9号为材料，利用常规PCR、试纸条、实时荧光定量PCR、酶联免疫吸附实验(ELISA)、Southern blot和全基因组重测序等检测方法，从DNA水平、mRNA水平、蛋白水平及Bt基因转录水平与表达水平的相关性进行研究，从中选育出外源基因遗传稳定性强、转录水平和表达水平高、拷贝数低且插入位点未破坏水稻内源基因的抗虫Bt水稻植株。主要结果如下:
　　1、利用Basta筛选、试纸条和常规PCR检测等方法，经过T0～T9代筛选，成功获得了Bt早粳稻空育131和Bt超级稻松粳9号，其中HD1（转cry1C*基因空育131）22个，HD2（转cry2A*基因空育131）10个，HD3（转cry1C*基因松粳9号）45个，HD4（转cry2A*基因松粳9号）26个。
　　2、利用real time PCR方法检测Bt水稻分蘖期和抽穗期各组织中Bt基因转录水平。检测结果表明:同一品系不同株系同一生长期相同组织间Bt基因转录水平存在差异;相同株系同一生长期不同组织间Bt基因转录水平存在明显差异，由高到低依次为叶片＞幼穗＞茎鞘;相同株系不同生长期相同组织间Bt基因转录水平也存在明显差异，表现为抽穗期＞分蘖期。
　　3、利用ELISA方法检测Bt水稻分蘖期、抽穗期、灌浆期和完熟期各组织中Bt蛋白的表达量。检测结果表明:同一品系不同株系同一生长期相同组织间Bt蛋白的表达量存在差异;相同株系同一生长期不同组织间Bt蛋白的表达量存在明显差异，在分蘖期表现为叶片＞茎鞘，抽穗期表现为叶片＞幼穗＞茎鞘，灌浆期表现为叶片＞茎鞘＞幼穗，且都高于完熟期糙米中Bt蛋白的表达量;相同株系不同生长期相同组织间Bt蛋白的表达量也存在明显差异，在HD1、HD3品系的叶片和茎鞘中表现为灌浆期＞抽穗期＞分蘖期，在HD2、 HD4品系的叶片和茎鞘中表现为灌浆期≈抽穗期＞分蘖期，在各品系的幼穗中表现为抽穗期≥灌浆期，且都高于完熟期Bt蛋白的表达量。
　　4、利用SPSS软件分析Bt水稻中Bt基因转录水平与翻译水平相关性。分析结果表明:在HD1、HD2、 HD3和HD4品系的叶片、茎鞘和幼穗中Bt基因转录水平与翻译水平均在0.01或0.05水平上表现出显著的正相关性。
　　5、利用Southern blot检测Bt水稻中筛选标记基因和目的基因拷贝数。检测结果表明:经过连续传代后，筛选标记基因和目的基因的遗传趋于稳定，各株系间拷贝数虽有所不同，但都介于1～2拷贝数之间。
　　6、利用植物全基因组重测序技术对优势Bt水稻植株HD1-3、HD2-2、HD3-2和HD4-3进行Bt基因插入位点测定。结果表明:Bt基因分别插入在各Bt水稻植株的第3号、第7号、第8号和第1号染色体上。

目录

摘要

第1章 引言

1．1 Bt杀虫晶体蛋白

1．1．1 Bt概述

1．1．2 Bt分类

1．1．3 Bt杀虫晶体蛋白作用机制

1．2 转基因植物的研究进展

1．2．1 外源基因导入植物细胞基因组的方法

1．2．2 转基因作物研究概况

1．3 水稻虫害治理进程

1．3．1 化学防治

1．3．2 生物防治

1．3．3 转基因防治

1．4 转Bt基因植物的检测技术

1．4．1 Basta抗感性检测

1．4．2 PCR检测

1．4．3 胶体金免疫层析检测

1．4．4 酶联免疫吸附检测

1．4．5 全基因组重测序

1．5 研究目的与意义

第2章 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 外源基因及表达载体

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要仪器

2．2 实验方法

2．2．1 Basta抗感性筛选

2．2．2 转Bt基因植株的PCR检测

2．2．3 Real-time PCR检测

2．2．4 Bt蛋白测定

2．2．5 Southern blot检测

2．2．6 外源基因的插入位点

第3章 结果与分析

3．1 转Bt基因水稻检测

3．1．1 Basta抗性检测

3．1．2 胶体金免疫层析检测

3．1．3 PCR检测

3．2 转Bt基因水稻目的基因的表达量

3．2．1 Bt基因转录水平测定

3．2．2 Bt蛋白表达量测定

3．3 相关性分析

3．4 转Bt基因水稻外源基因拷贝数

3．4．1 标记基因拷贝数

3．4．2 目的基因拷贝数

3．5 外源基因插入位点检测

第4章 讨论

4．1 培育转Bt基因早粳稻的意义

4．2 转Bt基因水稻Basta抗性检测的必要性

4．3 Bt基因应用

4．4 寒区“绿色超级稻’’培育

第5章 结论

参考文献

致谢

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