高效纤维素降解菌的筛选及其特性研究

摘要

纤维素是自然界中存在最广泛的一类碳水化合物，同时它也是地球上数量最大的再生资源。据不完全统计,全球每年通过光合作用产生的植物物质高达1.55×109t，其中有89％尚未被利用或未被合理利用(如直接焚烧)。目前全世界被开发利用的农林纤维副产物不足2%。因此将这部分可再生资源转变成可利用的能源，不仅可以减轻农业废弃物对环境的污染，更对能源危机的缓解具有重要意义。氢气作为清洁的、高品位二次能资源，越来越受到全世界的关注。在多种制氢方法中，利用微生物厌氧发酵生物质(有机废水、秸秆类农林业废弃物、有机垃圾等)制氢，具备治污、环保和产能等多重优越性，开发前景广阔，已成为各国关注的研究课题。
　　本文从牛粪堆肥中筛选到1株纤维素降解菌 G3与2株同步降解纤维素产氢菌(G2、G1)，通过对 G3进行16S rDNA鉴定，发现与 G3最相近的菌株为痢疾杆菌Shigalle flexneri strain FBD002，同源性为99％，对G1和G2的16S rDNA鉴定发现，G1、G2与鹑鸡肠球菌 Enterococcus gallinarum strain LMG13129最相近，同源性也达99%。
　　通过研究发现G3为一株纤维素糖化菌株，以PH-101Avicel为底物发酵40h，G3纤维素糖化率达到48.2%。G3在温度30-40oC和pH6.0-7.0的范围内都可以有效降解纤维素，最佳纤维素降解温度为37oC左右，最佳pH为6.5左右。G3的最适底物浓度5g/l，酵母粉最加添加量为1.5g/l。G1和G2利用纤维素产氢的单位体积产氢量(YH2)分别为97.5ml/L和82.0ml/L。纤维素降解率达到42.6％和36%，G1、G2在温度35-45oC、pH6.5-7.0的范围内都可以有效降解纤维素产氢，最佳纤维素降解温度为40oC左右，最佳pH为6.5左右。G3的最适底物浓度5g/l，氮源(Yesat extract)最适添加量为1.5g/l。
　　实验还用倍比稀释法从瘤胃液中分离得到一组最小的降解纤维素功能菌群(RCB)，以5g/l PH-101Avicel为底物，温度40℃，初始pH6.2条件下， RCB纤维素降解率为40%，利用纤维素产氢的单位体积产氢量(YH2)达到70 ml/L。
　　利用G1、G3二株纤维素降解菌和己糖产氢菌B49进行复配产氢实验，发现菌种复配时的纤维素降解和产氢能力大大高于各单菌株能力。尤其是G1+G3+B49二步法复配，静态发酵100h，以PH-101Avicel为底物时，纤维素降率和YH2分别达到60.5%和208.0ml/L。与G1单独发酵时相比，菌种复配的纤维素降解能力提高了20.6%，产氢量提高了53.1%。产氢能力达到4.0 mmolH2/g·纤维素。所以G1+G3+B49是纤维素降解菌与己糖产氢菌的复配方式。
　　将瘤胃中分离得到的降解纤维素最小功能菌群(RCB)与 B49二步法复配，结果表明当 RCB与 B49的接种比例为5：8时，体系有最佳的纤维素降解率与产氢量，分别为55.1%和165.7ml/L，分别较 RCB体系的纤维素降解率与产氢量提高了27.2%和51.5%。

目录

高效纤维素降解菌的筛选及其特性研究

ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF THE ANAEROBIC LIGINOCELLULOSE DEGRADATION BACTERIA

摘要

Abstract

第1章 绪论

1.1纤维素资源及应用

1.2纤维素的生物转化

1.3 利用纤维素类有机质发酵产氢

1.4混合菌种发酵产氢

1.5本课题的来源及研究目的与意义

1.6本课题的主要研究内容

第2章 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1菌种来源

2.1.2试验装置

2.1.3分离筛选纤维素降解菌的培养基配制

2.1.4分离瘤胃液中纤维素降解菌群的培养基配制

2.1.5主要仪器和设备

2.2实验方法

2.2.1牛粪堆肥中纤维素降解菌的筛选方法

2.2.2瘤胃液中高效纤维素降解功能单元的分离

2.2.3间歇发酵实验方法

2.2.4 发酵产物的分析方法

2.2.5 产氢指标的计算方法

2.2.6 纤维素降解程度分析方法

2.2.7 菌株电镜样品的制备方法

2.2.8菌株的16SrDNA基因克隆测序

2.2.9瘤胃液各稀释比例下降解纤维素最小功能单元的DGGE分析

第3章 高效纤维素降解菌的筛选及其生理特性

3.1高效纤维素降解菌G3及其产糖特征

3.1.1菌株G3的生理生化特征

3.1.2菌株G3的16SrDNA鉴定

3.1.3菌株G3的纤维素产糖特性

3.2高效纤维素降解产氢菌G1及其产氢特性

3.2.1菌株G1的生理生化特征

3.2.2菌株G1的16SrDNA鉴定

3.2.3菌株G1的纤维素降解产氢特性

3.3本章小结

第4章 瘤胃液中降解纤维素最小功能单元的筛选

4.1 瘤胃液中降解纤维素最小功能单元(RCB)的筛选结果

4.1.1 温度为38 oC，初始pH7.0条件下RCB筛选结果

4.1.2 温度为40 oC，初始pH6.2条件下RCB的筛选结果

4.2 PCR-DGGE技术分析瘤胃液中RCB的群落组成

4.3 本章小结

第5章 菌种复配降解纤维素产氢能力

5.1纤维素降解菌与己糖产氢菌复配方案

5.1.1纤维素降解菌与己糖产氢菌复配方式

5.1.2最佳复配方式的确定

5.2复配体系协同降解纤维素产氢能力

5.2.1复配体系协同降解纤维素能力分析

5.2.2复配体系协同产氢能力分析

5.2.3复配体系pH变化

5.2.4复配体系酸性液相末端产物分析

5.3瘤胃液中最小功能单元(RCB)与己糖产氢菌复配方案

5.3.1 RCB与B49复配方式

5.3.2 RCB与B49最佳复配方式的确定

5.3.3分析与建议

5.4本章小结

结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

哈尔滨工业大学硕士学位论文原创性声明

哈尔滨工业大学硕士学位论文使用授权书

哈尔滨工业大学硕士学位涉密论文管理

致谢