深海细菌Shewanella piezotolerans WP3细胞色素c相关基因的克隆表达和功能鉴定

摘要

深海是一个特殊的生态环境，这里永久高压、低温、黑暗、高盐和寡营养。生活在这些环境下的极端微生物必然有特殊的生理代谢途径来适应极端环境。对深海微生物的研究不仅有助于了解生命的起源，而且可以了解各种极端微生物的生活特性，为深海微生物资源的开发利用奠定基础。
　　2003年本实验室在西太平洋暖池区1914米的沉积物中分离到一株具有异化金属还原能力的耐压低温细菌，菌种鉴定为希瓦氏属新种，命名为 Shewanella piezotolerans WP3（以下简称 WP3）。WP3全基因组测序已经完成，并对其环境适应性机制做了功能基因组学分析。WP3拥有众多的基因和基因簇来帮助它适应极端环境。特别的是，WP3中包含55个编码细胞色素c的开放读码框（ORFs），是目前已测序Shewanella属菌株中最多的。
　　通过对WP3细胞色素c基因序列进行BLAST比对分析，推测在异化金属还原过程中，WP3可能存在两套电子传递系统，即mtrCAB基因簇和mtrFED基因簇。当WP3分别以延胡索酸和二氧化锰为唯一电子受体生长时，通过提取细胞总RNA并将mRNA反转录成cDNA，然后以cDNA为模板进行实时荧光定量PCR（RT-PCR），确定了细胞色素c相关基因转录水平的差异。结果表明，在二氧化锰还原过程下，mtrFED基因簇转录水平显著上调。这说明mtrFED基因簇可能在异化金属还原过程中起着重要作用。
　　由于WP3的mtrFED基因敲除突变株未观察到二氧化锰还原能力的显著下降，推测mtrFED基因簇在异化金属还原过程中可能只是起着辅助作用。为证实mtrFED基因簇在电子传递中的作用，首先借助生物信息学工具，对mtrFED基因簇的表达产物即细胞色素c蛋白进行了预测，包括它们的理化性质，跨膜区段，信号序列和功能结构域等；随后设计引物，对细胞色素c相关基因在体外进行了克隆表达，并在大肠杆菌中成功表达了具有氧化-还原活性的细胞色素c。
　　同时，本论文发展了一种基于删除信号肽的策略来过量表达这些膜蛋白，并采用Qiagen公司的Ni-NTA柱式纯化方法将其纯化。随后，已得到纯化的蛋白被用来制备抗体，通过免疫印迹杂交的方法，以期对目的蛋白在细胞内的表达水平和在细胞膜上的位置进行确定，为阐明WP3异化金属还原机制奠定基础。

目录

深海细菌Shewanella piezotolerans WP3 细胞色素c 相关基因的克隆表达和功能鉴定

CLONING, EXPRESSION ANDCHARACTERIZATION OF DEEP-SEA BACTERIAShewanella piezotolerans WP3 CYTOCHROME CRELATED GENES

摘要

Abstract

第1章 绪论

1.1 课题背景

1.1.1 深海微生物研究概况

1.1.2 Shewanella piezotolerans WP3研究现状

1.1.3 细胞色素c

1.2 课题相关研究进展

1.2.1 细菌异化金属还原代谢机制的研究进展

1.2.2 WP3中细胞色素c基因研究概况

1.2.3 细胞色素c克隆表达研究进展

1.3 本论文研究意义和目的及主要内容

1.3.1 课题的研究目的意义

1.3.2 论文主要内容

第2章 实验材料和方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌株和质粒

2.1.2 主要试剂及工具酶

2.1.3 主要仪器

2.1.4 工具软件

2.1.5 引物序列

2.1.6 常用培养基、溶液的配制

2.2 实验方法

2.2.1 细菌总RNA的提取与纯化

2.2.2 常用PCR技术

2.2.3 DNA克隆

2.2.4 蛋白表达和纯化

2.2.5 蛋白质浓度的测定

2.2.6 免疫印迹杂交（Western Blot）

第3章 不同电子受体条件下WP3细胞色素c基因的 差异转录

3.1 不同电子受体条件下WP3菌株总RNA的提取和纯化结果

3.1.1 不同电子受体条件下WP3菌株的生长状况

3.1.2 WP3菌株总RNA的提取结果

3.1.3 WP3总RNA的纯化效果

3.2 实时荧光定量PCR（RT-PCR）显示差异转录及结果分析

3.2.1 RT-PCR引物设计及验证结果

3.2.2 WP3细胞色素c基因差异转录

3.2.3 RT-PCR结果分析

3.3 本章小结

第4章 WP3细胞色素c相关基因序列分析

4.1 蛋白序列BLAST比对与理化性质预测

4.2 疏水性分析与跨膜区段预测

4.3 信号肽预测

4.4 功能结构域预测

4.5 本章小结

第5章 WP3细胞色素c基因的克隆表达与 生物学活性表征

5.1 mtrDEF基因簇的分子克隆

5.1.1 质粒的提取和酶切结果

5.1.2 目的基因序列PCR扩增和酶切结果

5.1.3 阳性克隆子筛选结果

5.2 WP3细胞色素c蛋白的表达和纯化

5.2.1 WP3细胞色素c蛋白表达

5.2.2 Western blot分析

5.2.3 蛋白纯化

5.2.4 Bradford法测定蛋白质浓度

5.3 WP3细胞色素c的生物学活性表征

5.3.1 Swp3274与pEC86共表达

5.3.2 细胞色素c生物学活性表征

5.4 本章小结

结 论

参考文献

附 录

攻读学位期间发表的学术论文

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哈尔滨工业大学硕士学位论文使用授权书

致 谢