可降解载药聚羟基丁酸-羟基乙酸酯涂层的生物性能研究

摘要

近年来，冠状动脉内支架植入术在国内外被广泛应用于治疗心血管疾病领域中，但其术后血管再狭窄严重影响其治疗效果，亟待解决。为此，本文设计一种以可应用于血管支架表面上的以可生物降解的羟基丁酸-羟基乙酸酯的共聚物(PHBHHx)为药物载体、以中国传统中药当归的有效提取物阿魏酸为药物的可降解载药涂层。本文首先采用体外检测方法研究了不同分子量PHBHHx的血液相容性和体外生物降解性能。其次，采用NaOH表面处理对材料表面进行改性，并研究了表面改性及其时效性对 PHBHHx生物相容性的影响。最后，本文还研究了载药PHBHHx的体外生物降解性能及释药性能，探讨了阿魏酸及NaOH处理对加速载药PHBHHx表面内皮化和抑制血管平滑肌细胞(VESCs)在其表面过度增殖所起到的作用。得到如下结果：
　　通过溶血实验、血浆复钙时间实验、凝血酶原时间实验、动态凝血时间实验以及体外血小板粘附实验评价了三种不同分子量PHBHHx的血液相容性，并与PLLA相比较。结果表明：PHBHHx的血液相容性随着材料分子量的增加而降低，三种不同分子量PHBHHx的血液相容性都比PLLA好。
　　研究PHBHHx的细胞粘附和细胞增殖性能可知：由于PHBHHx的表面较为疏水，其细胞粘附和增殖性能较差。采用NaOH处理可以有效地提高 PHBHHx的亲水性进而提高PHBHHx的抗凝血性能、细胞粘附及细胞增殖性能。究其原因，主要是由于NaOH对 PHBHHx表面的蚀刻作用以及大量的亲水性极性基团引入到PHBHHx表面，使得PHBHHx的亲水性有了较大提高。
　　进一步的研究发现：NaOH处理存在时效性的问题。产生时效性的根本原因是由于材料表面极性基团的部分减少。影响表面改性时效性的主要因素包括材料结晶度、材料的存储环境以及存储温度。通过适当提高材料的结晶度、在常规生物医用材料存储条件下将NaOH处理后的材料存储到4℃、亲水性环境中可有效降低时效性带来的不良影响，保持 PHBHHx膜表面良好的亲水性进而保持NaOH处理后材料良好的抗凝血性和细胞相容性。
　　通过比较不同载药PHBHHx的宏观、微观形貌及体外静态降解速度，确定了阿魏酸与PHBHHx重量比为5％和10%为研究范围内载药涂层中较为合适的载药量。研究了PHBHHx(5%)及PHBHHx(10%)膜的体外药物释放性能，结果表明：载药膜的体外药物释放存在快速释放期和稳定释放期两个释药阶段。快速释放期的药物释放以药物扩散为主，稳定释放期的药物释放与载药膜的降解行为有着紧密的关联性。
　　正交实验结果表明：影响载药涂层与镁合金基体间结合强度最大的因素是镁合金表面预处理工艺，其次是载药量，再次是涂层制备温度。研究范围内载药涂层与镁合金基体之间达到最高结合强度的制备工艺是：使用磷酸对镁合金基体进行表面预处理，载药涂层中的阿魏酸与PHBHHx重量比为5%，制备温度为40℃。此工艺下镁合金与载药涂层之间的结合强度为4.08±0.45MPa。
　　体外生物相容性实验表明：载药PHBHHx中阿魏酸的释放对血小板聚集及血栓形成有明显的抑制作用，可以有效地提高载药PHBHHx的抗溶血性能以及抗内源、外源凝血性能。而且阿魏酸的释放可以显著地促进内皮细胞在载药膜表面的粘附和增殖，达到加快内皮化的目的，同时，可以有效地抑制平滑肌细胞在其表面的过度增殖。
　　对载药PHBHHx表面进行NaOH处理后发现：一方面，NaOH处理提高载药膜表面的亲水性进而提高了载药膜表面内皮细胞的粘附和增殖，加速了内皮化进程；另一方面，NaOH蚀刻作用使得表面阿魏酸含量大幅减少，减少了阿魏酸在随后的释放，减弱了其对平滑肌细胞过度增殖的抑制作用。但是，总体来说，NaOH处理仍然有望通过加快内皮化进程来抑制平滑肌细胞的过度增殖，达到防治血管再狭窄的目的。

目录

可降解载药聚羟基丁酸-羟基乙酸酯涂层的生物性能研究

STUDY ON BIOLOGICAL PROPERTIES OFDEGRADABLE DRUG-LOADED POLY (HYDROXYBUTYRATE-CO-HYDROXYHEXANOATE) COATING

摘要

Abstract

目 录

第1章 绪论

1.1 研究的目的和意义

1.2 血管支架材料的研究进展

1.2.1 不可生物降解型金属材料

1.2.2 生物可降解型金属材料

1.2.3 天然生物材料

1.2.4 生物可降解型聚合物材料

1.3 血管支架材料的生物相容性

1.3.1 血液相容性

1.3.2 组织相容性

1.4 血管支架的表面改性

1.4.1 无机材料涂层

1.4.2 蛋白涂层

1.4.3 基因治疗

1.4.4 内皮细胞涂层

1.4.5 聚合物涂层

1.4.6 载药涂层

1.5 生物医用聚合物的表面改性

1.5.1 物理涂层或吸附

1.5.2 等离子体处理

1.5.3 表面接枝聚合

1.5.4 化学气相沉积技术

1.5.5 离子束注入技术

1.5.6 表面腐蚀或其它化学反应

1.6 研究思路与主要研究内容

1.6.1 问题的提出

1.6.2 研究思路

1.6.3 主要研究内容

第2章 实验材料与方法

2.1 实验材料与试剂

2.1.1 聚合物材料及药物

2.1.2 镁合金材料

2.1.3 实验试剂

2.2 实验仪器及设备

2.3 PLLA 和PHBHHx 膜的制备

2.4 载药PHBHHx 的制备

2.5 样品的表面改性

2.6 物理性能测试

2.6.1 SEM 观察

2.6.2 XPS 分析

2.6.3 WAXD 分析

2.6.4 FT-IR 分析

2.6.5 接触角测量

2.6.6 体外静态降解性能

2.7 血液相容性

2.7.1 溶血实验

2.7.2 血浆复钙时间实验

2.7.3 凝血酶原时间实验

2.7.4 动态凝血时间实验

2.7.5 体外血小板粘附实验

2.8 细胞相容性

2.8.1 BMSCs 的分离培养

2.8.2 BMSCs 的鉴定

2.8.3 HUVECs 的分离培养

2.8.4 HUVECs 的鉴定

2.8.5 VSMCs 的培养

2.8.6 细胞种植及粘附

2.8.7 MTT 法测定细胞活性

2.8.8 CCK-8 测定VSMCs 活性

2.8.9 细胞毒性检测

2.8.10 免疫荧光染色

2.8.11 H2O2 对细胞的损伤测定

2.8.12 H2O2 损伤后细胞活性的测定

2.8.13 胞外一氧化氮测试

2.9 载药涂层与镁合金基体间结合强度测试

2.10 药物释放的测定

2.11 统计分析

第3章 载体材料的选择及其生物性能初步评价

3.1 引言

3.2 表面形貌

3.3 亲水性

3.4 血液相容性

3.4.1 溶血率

3.4.2 凝血时间

3.4.3 体外血小板粘附

3.4.4 讨论

3.5 体外静态降解

3.6 细胞相容性

3.6.1 BMSCs 的鉴定

3.6.2 细胞粘附

3.6.3 细胞增殖

3.7 本章小结

第4章 PHBHHx 的表面改性及其时效性对生物相容性的影响

4.1 引言

4.2 PHBHHx 的表面改性

4.2.1 表面形貌

4.2.2 亲水性

4.2.3 XPS 分析

4.3 NaOH 处理对PHBHHx 抗凝血性能的影响

4.3.1 对凝血时间的影响

4.3.2 对体外血小板粘附的影响

4.4 NaOH 处理对PHBHHx 细胞相容性的影响

4.4.1 对细胞粘附的影响

4.4.2 对细胞毒性及细胞增殖的影响

4.5 PHBHHx 表面改性的时效性

4.6 表面改性时效性的机理分析

4.6.1 表面形貌观察

4.6.2 XPS 分析

4.7 影响表面改性时效性的主要因素

4.7.1 结晶度

4.7.2 存储环境

4.7.3 存储温度

4.8 表面改性时效性对PHBHHx 抗凝血性能的影响

4.9 表面改性时效性对PHBHHx 细胞相容性的影响

4.9.1 对细胞粘附的影响

4.9.2 对细胞增殖的影响

4.10 本章小结

第5章 载药PHBHHx 的体外降解与药物释放

5.1 引言

5.2 阿魏酸的化学成分、结构和性质

5.3 阿魏酸与PHBHHx 的化学相容性

5.3.1 FT-IR 分析

5.3.2 HPLC 分析

5.4 载药PHBHHx 中载药量的确定

5.4.1 不同载药PHBHHx 的宏观形貌

5.4.2 不同载药PHBHHx 的微观形貌

5.4.3 不同载药PHBHHx 的体外静态降解

5.5 载药涂层与基体间的结合强度

5.5.1 制备工艺的优化设计

5.5.2 影响因素分析

5.6 载药PHBHHx 的体外药物释放

5.7 本章小结

第6章 载药PHBHHx 的生物相容性

6.1 引言

6.2 载药PHBHHx 的亲水性

6.3 载药PHBHHx 的表面改性

6.4 载药PHBHHx 的血液相容性

6.4.1 溶血率

6.4.2 凝血时间

6.4.3 体外血小板粘附

6.4.4 讨论

6.5 载药PHBHHx 对BMSCs 的细胞相容性

6.5.1 阿魏酸对BMSCs 粘附的影响

6.5.2 NaOH 处理对BMSCs 粘附的影响

6.5.3 细胞增殖

6.6 载药PHBHHx 对HUVECs 的细胞相容性

6.6.1 HUVECs 的鉴定

6.6.2 阿魏酸对HUVECs 粘附的影响

6.6.3 NaOH 处理对HUVECs 粘附的影响

6.6.4 免疫荧光染色

6.6.5 细胞增殖

6.6.6 机理分析

6.7 载药PHBHHx 对VSMCs 的细胞相容性

6.7.1 阿魏酸对VSMCs 粘附的影响

6.7.2 NaOH 处理对VSMCs 粘附的影响

6.7.3 细胞增殖

6.8 讨论

6.9 本章小结

结论

参考文献

攻读博士学位期间发表的论文及其它成果

哈尔滨工业大学博士学位论文原创性声明

哈尔滨工业大学博士学位论文使用授权书

致谢

个人简历