大庆盐碱土可培养嗜盐细菌与古菌的多样性及多相分类研究

摘要

嗜盐菌由于具有独特的生理结构、遗传特性和代谢机制而引起国内外学者的广泛重视，是一类极具基础研究价值和开发应用前景的微生物资源。开发新的嗜盐菌种资源对于深入揭示嗜盐微生物的耐盐机制，发现新的耐盐相关基因，以及改造作物、改良利用盐碱地等方面具有重要意义。我国地域辽阔，海岸线漫长，存在大面积的盐碱地和众多盐湖，为嗜盐微生物的分离和系统分类工作的展开提供了得天独厚的条件。
　　本研究以黑龙江省大庆市典型苏打盐碱土作为研究对象，进行嗜盐微生物的分离和多相分类研究。采用稀释平板法，对盐碱地表层土壤样本（0～15cm）进行嗜盐微生物的分离和纯化，获得47株中度嗜盐细菌和10株极端嗜盐古菌。基于16S rDNA基因序列的系统进化分析表明，中度嗜盐细菌菌株分布在碱杆菌属（Alkalibacillus），芽孢杆菌属（Bacillus）和盐单胞菌属（Halomonas），极端嗜盐古菌属于盐陆生菌属（Haloterrigena）。分离株15-13T和JX313T分别是盐单胞菌属（Halomonas）和盐陆生菌属（Haloterrigena）潜在的新种。
　　采用形态特征观察、生理生化特性测定、细胞化学组分及基因型数据的分析等多相分类技术对分离株15-13T和JX313T进行分类地位的确定。研究结果表明，分离获得的中度嗜盐细菌菌株15-13T为革兰氏阴性的杆状，借助于2～3根侧生鞭毛运动；生长盐度范围1～23％ NaCl（w/v）（最适7%），生长温度范围20～50℃（最适35℃），生长pH范围7.0～11.0（最适pH9.5）；主要的脂肪酸为C18:1ω7c（60.48%），C16:0（13.96%）；基因组DNA G+C含量为67.6mol%；系统发育分析表明菌株15-13T是盐单胞菌科（Halomonadaceae）盐单胞菌属（Halomonas）的成员，与已知的潘泰莱亚盐单胞菌（Halomonas pantelleriensis） DSM9661T的系统发育关系最近（98.9%的16S rRNA基因序列相似性），DNA-DNA杂交试验显示两者之间的同源性为33.8%。结合表型特征、脂肪酸类型和基因型特征，确定菌株15-13T为盐单胞菌属（Halomonas）的新种，命名为耐碱盐单胞菌（Halomonas alkalitolerans sp.nov.），模式菌株为15-13T（=CGMCC1.9129T=NBRC106539T）。
　　极端嗜盐古菌菌株JX313T细胞为球形，革兰氏阴性，不运动，在蒸馏水中细胞不破壁，在固体培养基上生长7天后产生橙色色素；生长盐度范围可从10%NaCl（w/v）浓度至所在培养基中盐浓度达饱和，最适NaCl浓度为17.5%，生长温度范围20～50℃（最适35℃），生长pH范围8.0～11.0（最适pH10.0），基因组DNA G+C含量为59.3mol%。基于16S rRNA基因序列的系统发育分析表明，JX313T与盐陆生菌属（Haloterrigena）和钠线菌属（Natrinema）的成员相关，亲缘关系最近的种为盐田盐陆生菌（Haloterrigena salina）JCM13891T（96.2%的序列相似性）和伊斯巴尼亚盐陆生菌（Haloterrigena hispanica）DSM18328T（96.2%），进一步的DNA-DNA杂交试验显示 JX313T与盐陆生菌属（Haloterrigena）和钠线菌属（Natrinema）的相关种之间的同源性低于50%。此外，JX313T的最主要极性脂为phosphatidylglycerol（PG）、phosphatidylglycerol phosphate methyl ester（PGP-Me）和mannose-2,6-disulfate（1→2）-glucose glycerol diether（S2-DGD），符合盐陆生菌属（Haloterrigena）的极性脂特征。因此，系统进化分析、表型鉴定和化学分类数据表明菌株 JX313T为盐陆生菌属（Haloterrigena）的新种，并将其命名为大庆盐陆生菌（ Haloterrigena daqingensis sp.nov.），模式菌株为JX313T（=CGMCC1.8909T=NBRC105739T）。在菌株JX313多相分类研究的基础上，提出对盐陆生菌属（Haloterrigena）特征描述的修改。

目录

大庆盐碱土可培养嗜盐细菌与古菌的多样性及多相分类研究

BIODIVERSITY AND POLYPHASIC TAXONOMYOF CULTURABLE HALOPHILIC BACTERIA ANDARCHAEA FROM SALINE-ALKALINE SOILIN DAQING

摘 要

Abstract

目 录

Contents

第1章 绪 论

1.1 研究目的与意义

1.2 国内外研究综述

1.2.1 极端环境与极端微生物

1.2.2 高盐环境中的微生物

1.2.3 研究嗜盐微生物的意义

1.2.4 微生物多相分类研究方法

1.2.5 中度嗜盐菌的分类研究概况

1.2.6 极端嗜盐古菌的分类研究概况

1.2.7 大庆市生态环境概述

1.2.8 我国嗜盐菌分类研究的历史与现状

1.3 存在的问题

1.4 课题来源及主要研究内容

1.4.1 课题来源

1.4.2 主要研究内容

第2章 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 土壤样品

2.1.2 培养基

2.1.3 参考菌株

2.1.4 试剂和酶

2.1.5 试剂配制

2.1.6 实验主要仪器

2.2 实验方法

2.2.1 嗜盐菌的分离筛选

2.2.2 中度嗜盐菌的鉴定

2.2.3 极端嗜盐古菌的鉴定

第3 章 嗜盐菌株的分离筛选与多样性研究

3.1 土壤化学指标的测定

3.2 嗜盐菌株的分离与筛选

3.2.1 嗜盐菌的分离

3.2.2 嗜盐菌的筛选

3.3 中度嗜盐细菌的多样性

3.4 极端嗜盐古菌的多样性

3.5 关于嗜盐菌的分离与多样性的分析

3.5.1 嗜盐菌的分离培养

3.5.2 嗜盐菌的多样性分析

3.6 本章小结

第4章 中度嗜盐菌的多相分类研究

4.1 表型特征

4.1.1 形态学特征

4.1.2 生理学特征

4.1.3 生化和酶学特征

4.1.4 营养类型

4.2 化学分类特征

4.3 基因型特征

4.3.1 16S rDNA基因序列的系统发育学分析

4.3.2 基因组DNA G+C mol%含量和DNA-DNA杂交

4.4 关于盐单胞菌属（Halomonas）新分类单元描述的讨论

4.4.1 新分类单元生理学特性的分析

4.4.2 新分类单元脂肪酸组分的分析

4.4.3 新种的英文描述

4.5 本章小结

第5 章 极端嗜盐古菌的多相分类研究

5.1 表型特征

5.1.1 形态学特征

5.1.2 生理学特征

5.1.3 细胞低渗裂解试验

5.1.4 生化和酶学特征

5.1.5营养类型

5.2 化学分类特征

5.2.1 细胞色素分析

5.2.2 脂肪酸分析

5.2.3 极性脂类型

5.3 基因型特征

5.3.1 16S rDNA基因序列的系统发育学分析

5.3.2 基因组DNA G+C mol%含量和DNA-DNA杂交

5.4 关于盐陆生菌属（Haloterrigena）新分类单元描述的讨论

5.4.1 表型特征

5.4.2 化学分类特征

5.4.3 基因型特征

5.4.4 新种的英文描述

5.5 本章小结

结 论

参考文献

附 录

攻读博士学位期间发表的论文

哈尔滨工业大学学位论文原创性声明及使用授权说明

致 谢

个人简历