MARVELD1调控粘附相关基因mRNA加工和NMD机制的研究

摘要

细胞的无限增殖以及向周围组织侵袭转移是恶性肿瘤的两大重要的生物学特征，也是肿瘤致死率居高不下的关键原因。细胞的侵袭运动能力增强是肿瘤扩散的直接原因。多年来，研究者致力于揭示调控肿瘤细胞迁移运动的分子机制，但是到目前为止还远未完全阐明。
　　MARVELD1基因是本研究室在前期工作中获得的一个功能未知的新基因，全基因表达谱分析的结果显示：MARVELD1主要影响了mRNA加工通路和粘着斑信号通路相关基因的表达，同时还对MAPK细胞增殖通路的部分基因的表达有一定的影响。在前期工作中，MARVELD1对多种肿瘤细胞（尤其是肝癌细胞）增殖的影响均已得到了证实。此外，在前期的相互作用蛋白筛选中，研究发现MARVELD1与importinβ1存在相互作用。importinβ1是一类经典的介导核质运输的关键蛋白，参与了多种分子生物学通路，包括RNA的5′帽子结合蛋白CBP80和CBP20的核质循环、无义介导的RNA降解机制（NMD）等。NMD是一种RNA质量监控机制，大量研究表明，mRNA加工可能会激发 NMD通路活性。因此，本课题主要致力于解析MARVELD1与细胞黏附及相关联的细胞铺展和迁移运动、细胞粘附相关基因表达及其mRNA加工通路以及NMD机制的相关性。
　　细胞铺展是细胞侵袭运动的关键一步，而细胞与细胞外基质之间的粘附力是细胞铺展过程的基本驱动力之一。首先，本研究分析了MARVELD1对A549、H520以及NIH3T3细胞铺展过程的影响。实验结果表明MARVELD1负调控了以上细胞的铺展速率和面积。进一步的细胞粘附实验结果显示MARVELD1负调控A549和H520细胞与细胞外基质成分Collagen I以及Laminin V之间的粘附作用。在此基础上，通过划痕实验分析了MARVELD1对细胞迁移运动的影响，结果显示MARVELD1正调控了人肺癌细胞A549和H520的迁移能力。
　　细胞粘附是细胞侵袭运动的重要驱动力。为进一步研究MARVELD1影响细胞迁移运动的分子机制，本研究检测了MARVELD1对细胞粘附相关基因表达的影响，发现MARVELD1主要调控了FAK第397位酪氨酸的磷酸化水平以及integrinβ4、paxillin和integrinβ1的蛋白表达。结合前期的全基因表达谱分析结果，本研究重点分析了MARVELD1对以上三个基因的pre-mRNA和mRNA的相对含量的影响，发现MARVELD1可能主要调控integrinβ1基因的mRNA加工过程。进一步的研究发现，MARVELD1定位于RNA加工主要场所speckle小体，并与RNA的5′帽子结合蛋白CBP20存在相互作用。由于RNA加工过程与NMD机制相偶联，而且 CBP20是参与NMD机制的重要因子，所以该结果提示：MARVELD1可能也参与了NMD通路。
　　为明确 MARVELD1与NMD通路的相关性，本研究分析了MARVELD1对NMD报告基因和已知的内源靶转录本的稳定性的影响，结果显示MARVELD1显著提高它们的稳定性，因此也证实MARVELD1抑制了NMD通路活性。在研究其分子机制中，发现MARVELD1与重要的NMD因子UPF1和Y14存在相互作用，而且确定了MARVELD1与UPF1相互作用的关键氨基酸区域。MARVELD1抑制了UPF1与SMG1的相互作用，却促进了UPF1与importinβ1相结合。由于SMG1是UPF1的磷酸化激酶，所以本研究进一步探讨了UPF1的磷酸化水平，结果显示MARVELD1抑制了UPF1的丝氨酸磷酸化水平，阻断了后续SMG5与UPF1的相互作用。因此，综合上述实验结果，MARVELD1通过与UPF1相互作用抑制其丝氨酸磷酸化，阻断后续的SMG5介导的RNA降解进程，进而抑制NMD通路活性。
　　综上所述，本研究证实MARVELD1负调控了人肺癌细胞A549和H520的铺展及粘附能力，正调控了二者的迁移运动能力；影响了多种细胞粘附相关蛋白integrinβ1、integrinβ4、α-actinin、vinculin、paxillin、moesin、p-FAK（Y397）等的表达，对于integrinβ1基因，可能影响了其mRNA加工过程；MARVELD1通过影响NMD重要因子的活化，抑制NMD通路活性。

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第1章 绪论

1.1 课题背景及研究的目的和意义

1.2 肿瘤细胞迁移与mRNA加工的相关性

1.3 真核生物mRNA加工的调控机制

1.4 无义介导的RNA降解机制

1.5 MARVELD1基因研究现状

1.6本文主要研究内容和技术路线

第2章 实验材料与方法

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 本章小结

第3章 MARVELD1与细胞迁移运动的相关性

3.1 引言

3.2 MARVELD1对细胞铺展的影响

3.3 MARVELD1对细胞粘附的影响

3.4 MARVELD1对细胞迁移运动的影响

3.5 本章小结

第4章 MARVELD1调控粘附相关基因mRNA加工

4.1 引言

4.2 MARVELD1影响粘附相关蛋白表达

4.3 MARVELD1影响粘附相关基因mRNA加工

4.4 MARVELD1调控mRNA加工的机制分析

4.5 本章小结

第5章 MARVELD1抑制NMD通路活性

5.1 引言

5.2 mRNA加工与NMD机制的相关性

5.3 MARVELD1抑制NMD报告基因的降解

5.4 MARVELD1抑制内源NMD靶mRNA降解

5.5 MARVELD1不影响稳态翻译

5.6 本章小结

第6章 MARVELD1抑制NMD通路的机制研究

6.1 引言

6.2 MARVELD1与NMD关键因子相互作用

6.3 MARVELD1与UPF1相互作用区域分析

6.4 MARVELD1抑制UPF1与SMG1的结合

6.5 MARVELD1抑制SMG5与UPF1的结合

6.6 本章小结

结论

参考文献

攻读博士学位期间发表的论文及其它成果

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