银杏叶提取物对白介素-1β损伤大鼠关节软骨细胞的影响及机制研究

摘要

目的根据银杏叶提取物对其它组织和细胞具有清除氧自由基和一氧化氮(NO)，抑制炎症细胞中核因子-κB(NF-κB)核移位的研究，结合骨关节炎的发病机制中的NO和NF-κB的作用机制，本研究观察银杏叶提取物EGb对重组大鼠白介素-1β(rratIL-1β)损伤的大鼠膝关节软骨细胞的作用，并从自由基、一氧化氮、诱导型一氧化氮合酶、NF-κB信号转导、基质金属蛋白酶-13(MMP-13)等环节了解银杏叶提取物对受损伤软骨细胞的作用机制，为OA的预防和治疗摸索新的治疗药物和治疗途径。 方法1软骨细胞的培养及鉴定：半无菌环境下取1月龄清洁级wistar大鼠膝关节面软骨层，在无菌环境下消化得到软骨细胞，实验用细胞为第2代软骨细胞。采用检测培养物中的细胞外基质成分来确定软骨细胞，倒置显微镜观察细胞并照相。 2软骨细胞与rratIL-1β(5μg/L)、rratIL-1β(5μg/L)+不同浓度地塞米松(10-7、10-6、10-5mmol/L)、rratIL-1β(5μg/L)+银杏叶提取物EGb761(40mg、80mg、160mg/L)共同孵育，含正常细胞组共8组，72小时后，MTT法检测软骨细胞的增殖受到的影响；考马斯亮蓝G-250检测细胞总蛋白。 3同如上分组，软骨细胞在孵育24小时后取培养液上清，SOD、iNOS活性采用化学比色法测定，NO应用硝酸还原酶法测定，RT-PCR检测iNOSmRNA相对含量，观察EGb761对rratIL-1β损伤后的软骨细胞NO、iNOS活性、iNOSmRNA表达、SOD的影响。 4软骨细胞与rratIL-1β(5μg/L)、rratIL-1β(5μg/L)+地塞米松(10-6mmol/L)、rratIL-1β(5μg/L)+银杏叶提取物EGb761(40mg、80mg、160mg/L)共同孵育，含正常细胞组共6组，ELISA法检测细胞转录因子NF-κBp65的活化情况及大鼠基质金属蛋白酶-13含量。结果：1.培养细胞的细胞外基质部分存在酸性糖胺多糖呈异染性，呈浅蓝色或紫红色，鉴定培养细胞为软骨细胞的表型。细胞接种1周后在镜下可以见到较多呈圆形或多角形，分泌少量细胞外基质的软骨细胞，20天左右达到传代的标准。传代后，细胞变为多角形，细胞外基质分泌增多。 2.MTT法显示rratIL-1β对软骨细胞的增殖有明显的抑制作用，考马斯亮蓝试验显示细胞总蛋白分泌减少；地塞米松同EGb761均可对抗rratIL-1β的效应。EGb761的这种效应有剂量依赖性，而地塞米松没有这种效应。 3.rratIL-1β损伤后的软骨细胞NO、iNOSmRNA分泌增多、iNOS活性加强、SOD减少；地塞米松同EGb761均可对抗rratIL-1β增加NO、iNOSmRNA分泌、iNOS活性加强的效应，EGb761的对抗效应有剂量依赖性，而地塞米松没有这种效应；EGb761增加SOD作用强，并有明显的剂量依赖性；地塞米松改善软骨细胞分泌SOD的效应不明显。 4.rratIL-1β损伤后的软骨细胞核内NF-κBp65的活化显著增强，EGb761剂量依赖性的抑制这种效应；rratIL-1β损伤后的软骨细胞MMP-13分泌增多，EGb761剂量依赖性的抑制这种效应。 结论银杏叶提取物EGb761对rratIL-1β损伤的大鼠膝关节软骨细胞的具备很好的保护效应，EGb761通过清除自由基和NO，减少iNOSmRNA表达并抑制iNOS活性，抑制NF-κBp65活化，减少MMP-13生成等途径对抗rratIL-1β对大鼠膝关节软骨细胞的损伤作用，保护受损伤的软骨细胞，EGb761可能成为预防骨关节炎的药物应用于临床。

目录

缩略词表

前言

第一章银杏叶提取物对白介素-1β损伤大鼠关节软骨细胞增殖及细胞总蛋白的影响

第二章银杏叶提取物对白介素-1β损伤软骨细胞自由基及一氧化氮体系的影响

第三章银杏叶提取物对白介素-1β损伤软骨细胞核因子-kappaB及MMP-1 3的影响

结论

附图

文献综述一 银杏叶提取物对一氧化氮和核因子kappaB影响的研究进展

文献综述二白介素-1和自由基在骨性关节炎发病机制中的作用

致谢