固定CO2富油微藻的选育及基因转化藻株的构建研究

摘要

人类工业文明快速发展，不可避免地排放各种废气与污水，污染人类赖以生存的环境。作为温室气体的主要成分，CO2的减排势在必行，而利用微藻固碳被认为是降低 CO2水平最环保安全和可持续的方式。微藻技术用于烟道气CO2固定需要克服的最大难题是提高微藻固定CO2的能力，因此最为重要的是获得十分优质的藻种，同时，藻株既要具备繁殖快生长快、含油量高、容易回收的生物特性，同时还要具备高耐受性，可以在烟道气中有毒，有尘，高温的环境下生存；同时获得更多的副产物，比如微藻生物质。微拟球藻Nannochloropsis是真核单细胞藻类，具有很高的光合作用效率、生物量和油脂含量。目前，对有些微拟球藻株已建立了成熟的培养体系，多个藻株的全基因组序列业已公布，在微藻产油工业化应用研究中微拟球藻属已作为模式研究藻种被国内外研究人员广泛关注。因此，筛选富油微拟球藻耐受高浓度CO2的藻株，及通过基因工程的手段改良富油微藻的耐受高CO2的能力就变得非常有意义。
　　本研究采用光生物反应器以高浓度CO2条件对6株海洋微拟球藻进行了筛选及培养，分析发现海洋微拟球藻 N.oceanica、盐生微拟球藻 N.salina和眼点微拟球藻N.oculata这3株微藻可耐受5％CO2，生长良好。N.salina在5%CO2条件时，TAG含量最高，大于10%CO2条件生长受到抑制。在通入CO2条件下培养富含 TAG的淡水湖泊微拟球藻，考察其对亚硝态氮的耐受性，结果表明尽管该藻不能耐受很高浓度的CO2(>2%)，但该藻可以在含高浓度亚硝态氮(1mM NaNO2)的培养液中正常生长，也是一个在工业上有应用前景的优良藻株。在本研究中，我们克隆得到微绿球藻属的已定种的所有藻株微管蛋白β-tubulin启动子区域，并通过电击转化方法成功转化这个属的所有5个海水种的6株微藻。另外，建立了基于PCR扩增的双链DNA片段(PCR产物)的转化体系，得到比基于线性化的质粒转化更高的转化效率(10.7?61.2×10-6，1.5?13倍)。成功使用含有非抗性选择的GUS基因和仅含有选择标记盒的质粒对盐生微拟球藻N.salina进行共转化，共转化率超过50%。成功构建N.gaditana、N.salina及两株N.oceanica共4株微藻的，分别含有各自内源β-tubulin启动子及碳酸酐酶CA基因的RNAi片段的质粒载体 pks-TUBp-CAH2-RNAi，并对4株微拟球藻进行遗传转化，初步检测证实抗性基因已经插入阳性转化子的基因组中， RT-PCR结果提示碳酸酐酶CA基因表达下调，Western Blot分析显示碳酸酐酶蛋白表达也不同程度下调。通过对转化子藻株通入高浓度CO2培养，进行4种藻转化子的大规模初步筛选，结果显示除N.salina外的3种藻的转化子，耐受高浓度CO2的能力没有显著提高；而N.salina转化子在通入10% CO2时，比生长速率高于通入空气的野生型，耐受高浓度CO2的能力有明显提高，具有作为工业烟道气处理富油藻种的潜力。

目录

第1章 绪 论

1.1 课题来源

1.2 课题背景及研究的目的与意义

1.3 固定CO2富油微藻的研究现状

1.4 固定CO2微藻的基因工程研究

1.5 课题的主要研究内容

1.6 本课题研究的技术路线

第2章 试验材料与方法

2.1 试验材料

2.2 试验方法

2.3 分析方法

第3章 固定CO2微拟球藻筛选与培养

3.1 引言

3.2 海水微拟球藻耐高CO2的筛选与培养

3.3 淡水湖泊微拟球藻耐亚硝态氮的培养

3.4 本章小结

第4章 微拟球藻快速高效遗传转化系统的建立

4.1 引言

4.2 高效启动子的克隆

4.3 质粒转化载体及PCR转化产物的构建

4.4 微拟球藻的抗性基因电击转化及检测

4.5 微拟球藻遗传转化效率的比较

4.6 微拟球藻GUS报告基因的转化及检测

4.7本章小结

第5章 固定CO2相关基因的转化及其功能研究

5.1 引言

5.2 碳酸酐酶RNAi转化载体的构建

5.3 碳酸酐酶RNAi载体的转化及检测

5.4 高CO2浓度下N.salina转基因株的油脂积累分析

5.5 微拟球藻固碳机理的分析

5.6 本章小结

结论

参考文献

攻读博士期间发表的论文及其他成果

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致谢

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