电针对大鼠非酒精性脂肪性肝炎的治疗作用及机制研究

摘要

目的:随着社会的发展及人民生活水平的不断提高，非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)发病逐渐增多。本课题采用国内外公认的经典NASH动物模型，结合已有的关于NASH的研究成果，用病理学、生物化学、分子生物学等技术，探讨NASH状态下肝组织NF-κb和PPARrmRNA的表达情况，阐明电针治疗NASH的作用机制，为临床应用电针治疗NASH提供科学依据。 方法:将48只SD大鼠称重标记后按随机数字表随机分为2组：正常对照组12只；造模组36只。正常对照组采用普通饲料喂养；造模组采用高脂饲料喂养。实验依据范建高经典造模方法(标准饲料的基础上加2％胆固醇、13％猪油)复制NASH动物模型。12周后，从正常对照组随机抽取2只，造模组随机抽取6只，肝脏病理切片证实造模成功后，取剩余30只造模组大鼠称重，再随机分为模型组10只，电针组10只，药物组10只。正常组不进行电针和药物治疗，同前普通饲料喂养4周；模型对照组，不进行电针和药物治疗，同前高脂饲料喂养4周。针刺组取穴参照新世纪全国高等中医药院校规划教材《实验针灸学》大鼠针灸穴位定位方法及拟人比照法定位，选取双侧肝俞、足三里、丰隆、太冲，自第12周开始每天治疗1次，连续6天后休息1天，共治疗4周；药物组，自第12周开始每天以西药熊去氧胆酸(UDCA)250mg/kg.d的水溶液灌胃，继前高脂饲料喂养4周。各组大鼠在实验第16周隔夜空腹以2％戊巴比妥钠按2ml/kg量麻醉，经下腔静脉采血，迅速按常规分离血清；摘取肝脏。观察动物体重、食欲、行为、状态、毛发及死亡情况，计算肝指数(肝脏湿重/体重×100％)；采用Olympus Au560全自动生化分析仪测定血清ALT、AST、TG、TC、FFA、空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)；放射免疫分析法测定TNF-α、空腹血清胰岛素(fasting Insulin，FINS；计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR=FBGx FINS)/22.5)；肝组织匀浆生化测定MDA、SOD；电泳迁移率改变分析(EMSA)检测NF-KB活性；采用逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测PPARrmRNA；将肝组织用4℃生理盐水冲洗，在肝脏最大叶距边缘5mm处取小块肝组织，中性福尔马林固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察肝组织普通病理变化。另取1 mm<'3>肝组织，2.5％戊二醛及1％锇酸双固定，梯度酒精脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，HITACHI H7500透射电镜下观察肝细胞超微结构变化。 结果: 1.成功复制大鼠NASH模型。与空白模型组相比，电针组大鼠肝指数明显降低(P<0.05)，炎症活动程度皆有明显改善(P<0.05)；血清ALT、AST明显降低(P<0.05)。除正常对照组外各组大鼠肝组织均表现有不同程度的脂肪变性、炎症、坏死。电针组肝组织脂肪变性及炎症程度明显减轻，肝组织形态结构改善。 2.模型组血清TG、TC、FFA水平比正常组显著增高(P<0.05)；模型组比电针组显著增高(P<0.05)；电针组血清TG、TC水平较之药物组有下降趋势，但二者比较无明显差异(P>0.05)；药物组血清FFA水平较之电针组有下降趋势，但二者比较无明显差异(P>0.05)。 3.模型组肝组织MDA含量显著高于正常组(P<0.05)，SOD活性显著低于正常组(P<0.05)；电针组与模型组比较，MDA含量显著降低(P<0.05)，而SOD活性明显升高(P<0.05)；电针组与药物组比较，MDA含量有下降趋势，有统计学差异(P<0.05)；而SOD活性有下降趋势，但无统计学差异(P>0.05)。 4.模型组血清TNF-α水平比正常组显著增高(P<0.05)；电针组血清TNF-α水平比模型组显著降低(P<0.05)；电针组血清TNF-α水平与药物组比较无明显差异(P>0.05)。 5.模型组胰岛素抵抗指数水平比正常组显著增高(P<0.05)；模型组比电针组增高(P<0.05)；电针组与药物组比较无明显差异(P>0.05)。 6.模型组和药物组的 NF-KB 活性明显高于正常对照组(P值均<0.01)和电针组(P值均<0.05)。模型组、电针组和药物组大鼠肝组织P P A RrmRNA的表达均较正常对照组有不同程度的减弱(P值均<0.01)，模型组大鼠肝组织P P A RrmRNA的表达明显低于电针组(P<0.01)。 结论:氧化应激进而引起脂质过氧化和肝损伤，最终引起前炎症细胞因子产生，启动肝脏炎症反应；在NASH状态下NF-κB活性增强、PPAR rmRNA表达减弱，显示了三者之间的相关性。电针具有多靶位治疗NASH的作用： ①电针能明显降低NASH大鼠肝指数，改善肝组织脂肪变性、炎症活动程度及肝功能。 ②电针能降低血清脂质水平、减轻FFA的肝脏毒性、改善肝脏对脂质代谢的调节、减轻肝脏炎症反应。 ③电针能够提高肝组织抗氧化能力，减轻脂质过氧化。 ④电针能降低TNF-α的表达，减少细胞因子相关性损害。 ⑤电针能改善NASH大鼠IR状态。 ⑥电针能够抑制NF-KB的活性、促进PPARrmRNA表达。电针治疗NASH的作用可能是通过腧穴-经络．脏腑相关性及神经-内分泌-免疫网络整体调节实现的。

目录

论文说明：英文缩略词表

声明

前言

实验Ⅰ：电针对非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝组织病理及肝功能改变的影响

实验Ⅱ：电针对非酒精性脂肪性肝炎大鼠血脂水平的影响

实验Ⅲ：电针对非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝组织氧化及抗氧化状态的影响

实验Ⅳ：电针对非酒精性脂肪性肝炎大鼠血清TNF-α表达的影响

实验Ⅴ：电针对非酒精性脂肪性肝炎大鼠胰岛素抵抗指数水平的影响

实验Ⅵ：电针对非酒精性脂肪性肝炎大鼠NF-κB活性及PPARrmRNA表达的影响

讨论与结论

文献综述Ⅰ非酒精性脂肪性肝炎研究进展

文献综述Ⅱ中医药治疗脂肪肝的研究进展

在校期间发表论文及申报课题情况

致谢