小夹板弹性固定对骨折愈合过程的促进作用及其机理研究

摘要

本课题在国内外首次将传统的中国骨伤接骨术及小夹板固定技术用于实验性骨折中；采用先进检验指标评估骨折愈合质量，监测骨折愈合过程，及其有利于或促进骨折愈合的机理；将应变式压力传感器用于骨折外固定器中，较为准确地测出骨折端的微动幅度，为设计新的骨折外固定器提供了思路；得出的研究结果，将为传统的小夹板固定技术由经验型转变为科学型提供实验和理论基础． 研究目的：本研究以实验性兔胫骨骨折动物模型为研究对象，分别采用小夹板固定和钢板固定，小夹板固定中，通过调节小夹板扎带的松紧度使骨折断端承受不同的压力，观察骨折断端在二种不同的压力作用下对骨折愈合的影响，并与钢板固定组相比较，主要观察下列指标： 研究方法： 实验一： 1、实验材料： 1.1 动物：兔45只，体重2-2.5kg．由湖北省科学研究院动物实验中心提供。 1.2试剂： SP-9001 SP检验试剂盒SP-9002sP检验试剂盒由北京中杉试剂公司提供抗VEGF抗TGF-β1均由北京中杉试剂公司提供1.3仪器光学显微镜免疫组化仪器数件夹板：自制小夹板，由较好弹性杉树皮制作。分前、后、内、外侧四块夹板，夹板上宽下窄．前侧夹板长11cm，上端宽约2.4cm；后侧夹板长10cm，上端宽约2.4cm；内、外侧夹板长均为10 cm，上端宽均为1.9cm．在前侧、后侧夹板靠近胫骨结节部各刺—1.5mm小孔。 钢板：江苏金鹿集团医疗有线公司提供压力传感器：由武汉超字测控技术公司提供.构造如下图所示. 压力传感器主要有压力盒、导气管、三通、注气管，敏感元件以及半导体应变片等组成。其原理为：在压力测量之前，利用注气管将气体注入，使得气管内部充满气体，即使压力传感器的敏感元件两侧压力平衡，敏感元件不受应力作用．当压力盒受压力作用时，导气管内的气体受压使得敏感元件变形而产生应变，粘贴在敏感元件上的半导体应变片将压力变化产生的应变转换为电阻的变化，即建立了电阻变化与压力之间的定量关系。使用全差动测量电桥检测电阻变化，即可得出压力的变化关系．使用时，将压力传感器包入夹板内，通过传感器数值，确定夹板系带松紧程度． 2.实验方法： 2.1动物造模与分组：选用45只健康家兔，在左胫骨中下三分之一处，复制3mm标准横形骨折模型，随机分成A组、B组和C组，A组和B组用石膏固定，C组用四孔钢板内固定，五天后小心撤除A组和B组石膏，改用小夹板局部外固定。在兔胫骨结节处横穿一枚直经为1.5mm克氏针，再穿入前后侧夹板的眼内，以防夹板滑脱，压力传感器置于前侧夹板内面骨折的断端，再用四条扎带捆住四块夹板，夹板上扎带的松紧度不同，A、B组扎带上下移动分别约为3mm和7mm。此时读出A组压力传感器读数是18kPa，B组压力传感器读数是12kPa． 2.2标本的采集与处理：分别于术后14天，24天，34天处死A、B、C组每组各五只兔子，取胫骨骨折部上下方各1cm的骨干，10％福尔马林固定三天后，经5％硝酸脱钙，流水冲洗，酒精梯度脱水，浸腊包埋，纵向切片厚度4 μm．切片经二甲苯脱腊，梯度酒精水化，3％H2O2去离子水孵育5分钟灭活内源性过氧化物酶．蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，微波修复．滴加山羊血清封闭后，按1：100稀释的兔抗TGF-β1抗体和鼠抗VEGF抗体，4℃过夜。PBS冲洗3分钟，冲洗3次，滴加生物素化二抗室温孵育15分钟。PBS冲洗3分钟，冲洗3次，滴加辣根酶标记链霉卵白素，室温孵育15分钟，PBS冲洗3分钟冲洗3次，用二氨基联苯胺(DAB)显色，自来水冲洗，苏木素复染。梯度酒精脱水，透明后封片． 2.3观察指标：血管内皮生长因子(VEGF)、生长转化因子β1(TGF-β1)的表达; 实验二： 1、实验材料： 1.1实验动物：同实验一1.2仪器光镜透射电镜：H-500(日立)由广州军区武汉陆军总医院提供超薄切片机：由武汉大学医学院提供，瑞典LKB—II型2.实验方法2.1动物模型制作与分组同实验一2.2观察指标及方法2.2.1大体观察兔子处死后观察外骨痂，内骨痂，桥梁骨痂。 2.2.2组织形态观察：用耳缘静脉空气栓塞法处死兔子，于术后14天处死第一批兔子，24天处死第二批，34天处死第三批，每次每组5只．将胫骨标本于骨折部上下方各1cm处锯断，10％福尔马林固定备用，5％硝酸溶液脱钙，流水冲洗，梯度酒精脱水，石腊包埋，纵向切片，片厚4um，常规HE染色，再用光学显微镜观察． 2.2.3超微结构观察：前述方法和时间处死兔子后，立即取1mm3大小的标本，用2.5％戊二醛固定。1％EDTA溶液脱钙，缓冲液(PH7.2-7.4)冲洗三遍，再用1％饿酸后固定2h，缓冲液冲洗，酒精梯度脱水，环氧树脂812包埋，超薄切片，铅铀染色，透射电镜观察。 实验三： 1、材料与方法： 1.1 选用18只健康家兔，随机分成A组、B组、c组，动物造模和分组治疗同实验一1.2检测项目1.2.1 血清碱性磷酸酶指标：分别于术前及术后第2、4、6周每组取6只兔用9号针头经心脏采血2ml/kg，进行血清碱性磷酸酶(ALP)检测(由湖北中医院测定)． 1.2.2生物力学测试抗拉强度试验：三组动物在第六周时均采用耳缘静脉空气栓塞处死，解剖出左侧胫骨，清除软组织，纱布包裹，生理盐水浸透。将试验用骨在20±5℃的环境温度下放置不少于3h，，12小时内测量。然后用钢丝一端和兔胫骨固定，一端挂在LJ—500拉力机的夹具上，使用25mm/min拉伸速度进行拉伸试验，直至胫骨拉断，得到拉断力数据，拉断面应在骨折愈合处附近，如果拉断面在其他部位，则此样品试验数据弃除．每个固定方式得到六个有效拉断力数据，按骨外沿面积计算出骨的断面积，用拉断力除以断面积得到抗拉强度值，将六个抗拉强度数据按从大到小排序，第三和第四个数据的平均值为本固定方式的抗拉强度试验值，以MPa表示． 2、对实验结果作统计学处理。 实验四： 1、实验材料： 1.1 动物兔18只，体重2-2.5kg。由湖北省科学研究院动物实验中心提供． 1.2仪器QDR 2000plus型DEXA2实验方法。 2.1动物造模与分组：选用18只健康家兔，随机分成A组、B组、C组，动物造模和分组治疗同实验一，第6周末处死动物，拆除内外固定，解脱双后肢膝关节，剔除全部软组织，取双侧胫骨，保留骨膜． 2.2观察指标： 2.2.1 X线摄片观察： 每只动物在处死前先行X线摄片检查，以确定没有假关节形成．并观察骨痂生长和骨折愈合情况． 2.2.2骨密度测定： 采用QDR 2000plus型DEXA，以双能X线吸收法，对胫骨中段骨折区作骨密度(BMD)测定，均在骨折部位取一同等条件兴趣区R1，以骨折为中心由近至远扫描10厘米长距离．使用分析软件分析测定的数据来计算骨折端1cm感兴趣区域(Regions of Interest，ROIs)的BMD．同一动物的未手术侧标本在骨折对应部位扫描测量，作为自体对照数据。每一标本重复测定三次，每次测量后标本重置。DEXA由微机自动分析打印结果。计算每对标本的骨密度比率． 3、数据处理和统计学分析：参数比率的计算公式为：骨密度比率=对应未手术侧标本的测量值／手术侧标本的测量值×100％。各组骨密度的参数值用均数±标准差(x±s)表示． 研究结果： 1.免疫组化结果：在骨折愈合的各个阶段，各组中TGF-β1在细胞中的表达增加，VEGF在细胞中的表达亦增加，二者存在着一定的协调关系．在骨折愈合的早期及中期，血管形成的量及时间A组早于B组和C组，骨痂形成的量亦高于B组和C组，因此阳性表达较B组及C组早，阳性程度明显优于B组和C组。 2.大体观察： A组：14天骨折段已初步联接，见少量的梭形外骨痂，24天时，骨痂外形呈梭形，骨痂将两骨折段桥接，34天，已由骨痂将骨折段牢固联接在一起，骨折端无活动度。B组：在14天时，处死的5只兔子有1只骨折端有错位；24天时，骨折端有部分联接，但活动度较大，外骨痂较A组少，34天时可见骨痂中等，呈梭形。骨折端未完全由骨痂联接，骨折线仍清晰可见。C组：各时间段骨折端均无错位情况，14天时见纤维连接，24天时见中等量的散在的外骨痂，排列不整齐，未成梭形连接两骨折端，34天时，外骨痂部分成梭形连接两骨折端，但连接的不牢固． 3.电镜观察显示A组在骨折愈合过程中，成骨细胞出现早，数量较B组和C组均多，且功能活跃，34天时骨折端见大量功能活跃的骨细胞。 4.组织学检测显示，A组骨外膜骨痂，桥梁骨痂能早期加速形成，并逐渐形成连接骨痂，封闭骨痂，骨小梁坚韧，34天时骨痂已连接骨端，骨折端进行编织骨向板层骨转化，明显优于B组和C组. 5.血清碱性磷酸酶结果：各组不同时期家兔血清AKP的变化幅度不同，14d时A组血清碱性磷酸酶含量明显高于B组和C组(P<0.01)． 研究结论：微动能明显促进骨折愈合；A组动物骨折愈合时间最短，其在促进骨折愈合的速度、及质量上有明显的优越性。恰当的小夹板固定能改善骨折局部血循环;增加骨生成细胞的数量，促进骨生成细胞分化、成熟，促进骨折断端矿物质的沉积、提高骨折断端强度，提高骨折愈合质量，缩短骨折愈合时间．

目录

论文说明：中英文对照缩略词表

声明

前言

实验一小夹板固定对实验性骨折愈合的VEGF及TGF-β1表达的影响

实验二小夹板外固定用于实验性兔长管状骨骨折的组织学和超微结构的观察

实验三小夹板固定对兔胫骨骨折愈合影响的生物力学实验研究

实验四小夹板固定对实验性长管状骨骨折愈合骨密度的影响

(五)全文结论及讨论

论文相关图片

参考文献

综述骨折弹性固定条件下骨折端“微动”对骨折愈合的影响

三年博士研究生学习期间科研、论文情况

致谢