集成微流控芯片及单细胞基因表达检测研究

摘要

微/纳制造主要研究特征尺寸在微米、纳米范围的功能结构、器件与系统在设计、制造中的科学问题，是衡量国家制造水平的标志之一，代表着目前制造科学的最前沿。细胞是生命结构和功能的基本单位，活体单细胞基因表达检测是细胞生命分析技术的极限状态，对于揭示重大疾病发生与演进机理、促进新型药物研发等具有重要意义，正在成为基础生物学、临床医学等领域的国际前沿课题。本文将微/纳制造技术与单细胞基因表达检测结合，研制出微流控芯片系统使常规生化试验的多步骤操作全部集成微缩到单块芯片，实现单细胞内低丰度mRNA样本的萃取、扩增与检测，主要研究内容有以下几个方面。
　　设计布局清晰、结构简单、操纵更灵活的两类芯片微系统，即单工作单元式和微流控阵列式芯片。前者利于实现便携操作和分析，后者提高了检测效率和通量。两类芯片均为多层结构，包含微流动层、控制层、薄膜夹层和含加热器的微传感器，在加工中改进同类芯片工艺，解决了工程实际中PDMS薄膜局部粘附、热循环反应试剂蒸发和传感器复用性等问题。此外，基于固体、流体传热学理论，借助通用商业软件对芯片含加热器的微传感器进行建模与仿真研究，评估该设计的温控性能。
　　研发试验系统平台，共包含4个部分，即微流控平台、温度控制平台、细胞培养试验平台和生物信号检测平台。其中，微流控平台由无极调速微注射泵、液氮池及整流阀和显微镜组成，用于实现活体单细胞操纵及多种反应试剂的精确、稳定进样；温度控制平台基于虚拟仪器技术，开发了控制程序和人机交互界面，以实现芯片反应温度的实时检测和精确控制；细胞培养试验平台由层流生物试验台、细胞培养箱、离心机等组成，用于细胞样本制备、生化试剂配制和活体细胞的药物预处理等操作；生物信号检测平台由荧光倒置显微镜、CCD及相关图像采集与分析软件组成，用于实现生物荧光信号的高信噪比、实时精确测量和分析。
　　针对微流控系统中流体对细胞的水动力作用难以试验测量，且细胞活性受水动力影响较大，本文应用计算流体力学、弹性力学和塑性力学理论，借助任意拉格朗日-欧拉法动力学描述、动网格技术和参数化数值求解方法，建立并求解两类芯片的2D、3D细胞-微流体流固耦合有限元模型。通过模拟细胞捕捉瞬态过程，分析流场中细胞所受的多属性水动力作用，量化芯片入口载流流速与细胞表面压力、应力分布的关系。并且，将芯片上的细胞受力与正常人体动脉血管、毛细血管和组织液中的细胞受力进行对比，预测试验参数对细胞生理活性的影响。
　　选取MCF-7人乳腺癌细胞系，基于微磁珠固相萃取技术及实时荧光定量反转录聚合酶链反应（RT-qPCR）分子扩增与检测技术，提出全集成检测方法。该方法将微流控单细胞捕捉、细胞裂解、mRNA萃取、反转录、基因片段扩增与实时定量检测等所有试验步骤完全集成到一个芯片，在简化操作、缩短周期的同时提高低丰度mRNA样本的保持度，并由此提高检测精度、灵敏度和信噪比。本文依次评估了方法可行性和可重复性，优选了细胞操纵与mRNA固相萃取试验方案，分析了该方法与传统方法的效能差异等；并且，检测了MMS诱导前后单细胞内持家基因GAPDH与细胞周期调控基因CDKN1A表达水平的差异，验证其药代动力学机理；此外，分别建立MMS剂量、用药时间对CDKN1A表达调控的影响，提出与本试验条件对应的最优治疗方案。
　　在理论上，本文改善了现有研究方法的集成度、多功能性和实验操作的自动化水平，并对同类单细胞、单分子生化分析具有普适性；在工程实际中，降低了现有芯片设计、制造和操作中普遍存在的复杂度、高成本和高消耗，且可根据需求变更而灵活调整，具有一定的产业化前景。研究方法与结论在推进微/纳制造技术与基础科学研究结合，促进基础生物医学研究，提升临床诊治水平等方面具有一定的价值和意义。

目录

第1章 绪 论

1.1课题来源

1.2 课题研究背景和意义

1.3 国内外相关技术发展概况

1.4 本文主要研究内容

第2章 集成微流控芯片研制

2.1 集成微流控芯片设计

2.2 含加热器的微传感器设计与传热性能评估

2.3 微流控芯片工艺设计与实现

2.4 本章小结

第3章 单细胞基因表达检测系统设计与构建

3.1 单细胞基因表达检测试验系统总体设计

3.2 微流控平台设计与构建

3.3 芯片温控平台设计与构建

3.4 细胞培养与传代试验平台构建

3.5 生物分子荧光信号检测与分析平台设计与构建

3.6 本章小结

第4章 单细胞操纵流-固耦合动力学仿真分析

4.1流-固耦合建模基础

4.2 流-固耦合动力学有限元建模方法

4.3 单工作单元式芯片模型求解与分析

4.4 微流控阵列式芯片模型求解与分析

4.5 本章小结

第5章 集成微流控单细胞基因表达检测方法与试验

5.1 温度传感器校验与温控性能评估

5.2 荧光信号检测系统背景噪声评估

5.3 微磁珠总量优选分析

5.4 基于XenoRNA样本的微磁珠捕捉容量分析

5.5 集成微流控方法评估

5.6 微流控qPCR效率及检测灵敏度分析

5.7 水动力单细胞捕捉效率分析

5.8 单细胞化学裂解/混合时间优选分析

5.9 MCF-7单细胞CDKN1A基因表达检测与分析

5.10 本章小结

第6章 平行化微流控单细胞基因表达检测方法与试验

6.1阵列式芯片温度传感器校验与评估

6.2 微磁珠平行化XenoRNA样本捕捉容量分析

6.3 微流控平行化RT-qPCR可行性分析

6.4 阵列式芯片平行化RT-qPCR可重复性分析

6.5 平行化qPCR效率及检测灵敏度分析

6.6 平行化单细胞基因表达检测与分析

6.7 平行化MMS诱导单细胞基因表达检测与分析

6.8 MMS剂量对CDKN1A表达上调作用分析

6.9 MMS处理时间对CDKN1A表达上调作用分析

6.10 本章小结

结论

参考文献

附录 1 网格剖分精度分析

附录 2 网格独立性分析

攻读博士学位期间发表的论文及其它成果

声明

致谢

个人简历