基于藻蓝蛋白为荧光探针检测重金属的方法及应用

摘要

C-藻蓝蛋白属于藻胆蛋白中的一种，广泛存在于海洋藻类中，它是一种天然的荧光剂，分离纯化方法较简单，成本低并且容易大量获取。利用其荧光特性，将其作为高效的荧光探针，用于医学诊断、临床医学、环境监测等方面。随着我国工业化的发展，海产品中的重金属污染问题日益突出，对人类健康造成一定的威胁，因此，检测海产品中重金属离子的浓度是至关重要的。传统的检测方法涉及到复杂精密的仪器、繁琐的操作流程等，使其应用受到一定的限制，不足以满足重金属快速实地检测的需要，因此，有必要建立一种简单、经济、快速、可以进行实地检测的重金属检测技术。本论文基于 C-藻蓝蛋白荧光特性，开展其在重金属快速检测中的应用研究，主要包括以下几个方面的内容：
　　以极大螺旋藻为材料，采用细胞破碎-盐析-透析-层析的工艺流程分离 C-藻蓝蛋白。采用反复冻融结合超声波破碎的方式破碎细胞，经70%饱和度的硫酸铵盐析后，C-藻蓝蛋白纯度（A620/A280）为0.7；将C-藻蓝蛋白粗提液进行羟基磷灰石柱层析纯化，纯化后其纯度达到4.1；C-藻蓝蛋白的紫外-可见吸收光谱表明其最大吸收峰在620 nm处，此外，在280 nm和360 nm处还存在两个吸收峰；SDS-PAGE凝胶电泳结果表明C-藻蓝蛋白两个亚基分子量约为19.0 kDa与21.0 kDa；C-藻蓝蛋白的荧光光谱显示其在580~600 nm之间存在激发峰，发射峰在640 nm。以上结果为后期C-藻蓝蛋白的应用研究提供了理论依据。
　　通过考察C-藻蓝蛋白对15种常见重金属离子的荧光响应，发现其对汞离子的选择性和专一性较好；通过荧光显微镜研究猝灭机理，发现汞离子的加入会使 C-藻蓝蛋白发生聚集现象，这可能是汞离子导致 C-藻蓝蛋白荧光猝灭的原因。经优化后，确立了C-藻蓝蛋白荧光探针对汞离子的最佳检测条件：pH为7.0、C-藻蓝蛋白浓度为0.050 mg/mL、检测时间为10 min、体系温度为30℃。依据不同浓度汞离子与C-藻蓝蛋白之间的荧光猝灭效应，建立了标准工作曲线，检出限（LOD）为0.008μM；此外，此方法成功应用于牡蛎和银鲳鱼样品中的汞离子检测，其回收率为93.6~107.2%。
　　本研究以C-藻蓝蛋白为保护剂，AgNO3为原料，NaBH4为还原剂合成了藻蓝蛋白-银纳米粒子（PC-AgNPs），经过优化，确定了PC-AgNPs的最佳合成条件：0.20 mg/mL C-藻蓝蛋白中加入AgNO3和NaBH4使其终浓度分别为0.35 mM和0.40 mg/mL，在pH为7.0，温度为30℃条件下搅拌2 h。PC-AgNPs在400 nm处有最大紫外吸收峰，其荧光激发波长位于580 nm处，发射波长位于625 nm处；PC-AgNPs在透射电子显微镜下呈球形分布，粒径大致分布在10~25 nm左右。此外，研究发现将铜离子加入PC-AgNPs之后出现荧光猝灭现象。
　　本研究经过一系列提取纯化过程获得了纯度较高的 C-藻蓝蛋白，基于其荧光特性开发了汞离子的快速检测技术，具有检测时间短、灵敏度高的优点。此外， C-藻蓝蛋白荧光探针还具有纯天然的特点，不会对检测样品造成二次污染，在海产品中汞离子检测方面具有广阔的应用价值。以 C-藻蓝蛋白为保护剂合成PC-AgNPs，铜离子对 PC-AgNPs的荧光具有明显的猝灭作用，这表明 PC-AgNPs在铜离子的检测方面具有潜在的应用前景。

目录

第1章 绪 论

1.1 藻胆蛋白简介

1.2 藻蓝蛋白简介

1.3 纳米材料简介

1.4 重金属离子检测方法概述

1.5 课题来源和研究的目的意义及内容

第2章 C-藻蓝蛋白的提取与分离纯化

2.1 引言

2.2 材料

2.3 方法

2.4 结果与讨论

2.5 本章小结

第3章 C-藻蓝蛋白在海产品中汞离子检测的应用

3.1 引言

3.2 材料

3.3 方法

3.4 结果与讨论

3.5 本章小结

第4章 PC-AgNPs的合成与表征

4.1 引言

4.2 材料

4.3 方法

4.4 结果与讨论

4.5 本章小结

结论

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文及其它成果

声明

致谢