正常人与肺结核病人rhIL-2扩增的CD3+CD56+NKT细胞生物学活性的比较研究

摘要

研究背景：ΝΚΤ（natural killer T)细胞是一群细胞表面既有T细胞受体(TCR)，又有NK细胞受体的特殊T细胞亚群。该群细胞具有抗感染，抗肿瘤，免疫调节等多重功能。虽然共表达T细胞受体和NK细胞受体可以作为NKT细胞的表型指标，但是NKT细胞是一个复杂的异质性群体，其确切的定义仍未取得一致意见。已经有研究发现 CD3+CD56+NKT细胞是细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer，CIK)中的主要效应细胞，其含量的多少与CIK的细胞毒活性的高低有关。目前 CIK过继免疫治疗肿瘤的方法在临床已得到应用，但是针对结核病的细胞过继免疫疗法还很少研究。由于结核病的致病菌结核杆菌是一种胞内寄生菌，机体对它的消灭也依赖细胞免疫，所以有关结核病的细胞过继免疫疗法的研究有望成为攻克结核病的一个全新的领域。
　　目的：从活化规律、细胞数量、表型和分泌细胞因子四方面比较正常人与肺结核病人新鲜外周血中 CD3+CD56+NKT细胞的差异；分别观察正常人与肺结核病人PBMC(peripheral blood mononuclear cells)用rhIL-2刺激后CD3+CD56+NKT细胞的增殖规律，再从细胞数量、表型和分泌细胞因子三方面比较正常人与肺结核病人rhIL-2扩增后的CD3+CD56+NKT细胞的差异，以期为探讨肺结核病的发病机制和治疗方法开辟一个新的道路。
　　方法：
　　1.淋巴细胞各亚群的检测方法：正常人与肺结核病人外周静脉血收集于肝素钠抗凝的真空采血管内，于4小时内完成流式抗体染色处理过程，利用流式细胞仪获取数据并分析结果，最终得出淋巴细胞各亚群的数值。
　　2.活化指标 CD69的检测方法：密度梯度离心法获取外周血单个核细胞(PBMC)，用rhIL-2刺激PBMC，分别于刺激后0、8、16、40和64小时检测NK细胞和NKT细胞表面CD69的表达情况。
　　3. rhIL-2扩增 NKT细胞的方法：密度梯度离心法获取外周血单个核细胞(PBMC)，加入 rhIL-2刺激培养人外周血单个核细胞(PBMC)，以后每2-3天补充rhIL-2和新鲜RPMI1640完全培养液继续培养细胞两周，分别于培养第0、6、10和14天检测NKT细胞比例并计数。
　　4. NKT细胞的表型和胞内细胞因子检测：于培养第0天和第14天收集细胞，流式细胞仪检测NKT细胞的表面分子γδTCR、CD4、CD8和CD161的表达情况以及胞内细胞因子IFN-γ、IL-4、TNF-α和IL-17的分泌量。
　　结果:
　　1.肺结核病人(n=42)与正常人(n=30)相比，NKT细胞和 Th细胞比例未发生显著变化，NK细胞比例显著增加(P<0.05)，Th/Tc比值显著增加(P<0.01)，而T细胞、γδT细胞、Tc细胞和B细胞都显著降低(P<0.01)。
　　2. PBMC经rhIL-2刺激0h、8h、16h、40h和64h后，正常人NK细胞和NKT细胞表面CD69表达量均显著增加（与0 h比较，P<0.01）。肺结核病人NK细胞和NKT细胞表面CD69表达量也显著增加（与0 h比较，P<0.01）。肺结核病人组与正常组比较，NK细胞表面CD69表达量除0 h无显著差异（P>0.05），其余各时间点表达量均高于正常组（P<0.01、P<0.01、P<0.05、P<0.05）；NKT细胞表面CD69表达量除64 h无显著差异（P>0.05），其余各时间点表达量均高于正常组（P<0.01、P<0.05、P<0.05、P<0.01）。
　　3.正常人PBMC在rhIL-2刺激培养14天后，细胞总数由（0.86±0.18）×106扩增到（38.28±4.56）×106（P<0.01），细胞扩增了45.79±7.77倍；NKT细胞绝对数则由（5.57±5.16）×104扩增到（1475.05±868.98）×104（P<0.01），细胞扩增了246.26±134.06倍；NKT细胞相对比例由（5.14±2.11）％扩增到（38.57±21.95）%（P<0.01）。结核病人外周血单个核细胞在rhIL-2刺激下也会显著扩增，细胞总数由（0.95±0.19）×106扩增到（18.15±1.73）×106（P<0.01），细胞扩增了19.77±4.82倍；NKT细胞绝对数由（3.44±1.20）×104扩增到（323.23±75.98）×104（P<0.01），细胞扩增了108.69±59.22倍；NKT细胞相对比例由（3.67±1.25）%扩增到（17.67±3.23）%（P<0.01）。两组比较，肺结核病人NKT细胞扩增效率显著低于正常人。
　　4.正常人外周血中NKT细胞高表达CD8，扩增后的NKT细胞则高表达γδTCR、CD161；结核病人外周血中NKT细胞CD8表达量低于正常人，扩增后NKT细胞γδTCR降低， CD8、CD4、CD161的表达量则增高，γδTCR、CD4的表达量低于正常人，CD8、CD161的表达量则高于正常人。
　　5.正常人外周血中NKT细胞能够分泌IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-17，扩增后NKT细胞分泌IFN-γ、TNF-α的量显著增加；肺结核病人外周血中NKT细胞也能够分泌 IFN-γ、TNF-α、IL-4和 IL-17，但扩增前后这些细胞因子的量无差异；正常人扩增后的NKT细胞分泌IFN-γ、TNF-α的量显著高于肺结核病人。
　　结论：
　　1.肺结核病人的T细胞、γδT细胞、Tc细胞和B细胞低于正常人，NK细胞、Th/Tc比值高于正常人，而NKT细胞、Th细胞则与正常人相似。
　　2.肺结核病人NK细胞，NKT细胞的活化均高于正常人。
　　3.肺结核病人的NKT细胞增殖应答低于正常人。
　　4.肺结核病人NKT扩增后的γδT细胞比例比正常人低。
　　5.肺结核病人的IFN-γ、TNF-α产生低于正常人。

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中文摘要

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前言

材 料 和 方 法

1. 实验材料

2、实验方法

3. 统计学处理

结果

1. 正常人与肺结核病人外周血中CD3+CD56+NKT细胞的比例：

2. 正常人与肺结核病人NK细胞和NKT细胞表面CD69随时间变化趋势：

3. 正常人与肺结核病人rhIL-2活化的PBMC中CD3+CD56+NKT细胞的增殖规律：

4. 正常人与肺结核病人CD3+CD56+NKT细胞扩增前后数量的比较：

5. 正常人与肺结核病人CD3+CD56+NKT细胞扩增前后表型的比较：

6. 正常人与肺结核病人 CD3+CD56+NKT 细胞扩增前后分泌细胞因子的比较：

讨论

结论

参考文献

致谢

附录A英文缩略词表

附录B常用试剂配制

附录C个人简历及发表论文

附录D 综述：NKT细胞—一个复杂的异质性群体