溶瘤Ⅱ型单纯疱疹病毒oHSV2联合CAR-T抗胃癌疗效研究

摘要

在过去的几年中，来自多个研究机构的临床试验证明，在治疗B细胞恶性肿瘤方面，包括B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）、B细胞非霍奇金淋巴瘤（BNHL）、慢性淋巴细胞白血病（CLL）和霍奇金淋巴瘤（HL）以CD19、CD20或CD30为靶点的CAR-T细胞的临床试验显示出了优异的结果。但是当CAR-T用于实体瘤的治疗时，往往存在靶点的选择，在体内的定位等问题的限制。同时，CAR-T细胞还会受到肿瘤微环境和一些免疫细胞的抑制。 溶瘤病毒是一类能选择性感染和损害肿瘤组织但对于正常组织无害的具有成药潜力的病毒，常见的溶瘤病毒包括Ⅰ型单纯疱疹溶瘤病毒、呼肠孤病毒、腺病毒等。由溶瘤病毒造成的肿瘤细胞的裂解会释放出大量的肿瘤相关抗原，这些抗原的释放会进一步被机体的免疫系统所识别，从而激活相关的免疫细胞对肿瘤细胞进行杀伤。目前已有报道，溶瘤腺病毒和CAR-T细胞联合能够对头颈部肿瘤起到更好的疗效。本课题采用的溶瘤病毒是本实验室前期改造的：重组人GM-CSF溶瘤Ⅱ型单纯疱疹病毒（Oncolytic herpes simplex virus type2，oHSV2）是在野生型Ⅱ型单纯疱疹病毒株（herpes simplex virus type2，HG52）的基础上剔除了免疫抑制基因和神经毒性基因并插入了人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（hGM-CSF）的表达序列。插入了hGM-CSF基因片段的oHSV2可以诱导机体的免疫应答反应。本研究设想针对现有的CAR-T细胞疗法，加入了oHSV2进行联合治疗，通过溶瘤病毒来调节肿瘤微环境，研究oHSV2是否能帮助CAR-T细胞获得更好的针对胃癌的治疗效果。 本研究在分子水平上成功的构建了靶向CD19的嵌合抗原受体表达框和重组慢病毒，通过蛋白免疫印迹对CD19-CAR进行了验证。同时制备了靶向CD19的CAR-T细胞，并在细胞水平上验证了CAR-T对Raji细胞的杀伤能力。由于目前还未发现胃癌肿瘤细胞有稳定的抗原，因此我们利用PiggyBac转座子系统，构建了稳定表达CD19的BGC823单克隆细胞系，进一步在细胞水平验证了CAR-T细胞对BGC823-CD19细胞的杀伤能力。结果表明，CAR-T能够对CD19阳性的细胞产生特异性的杀伤，但对CD19为阴性的细胞杀伤水平大大减弱。 此外，研究成功建立了NSG小鼠胃癌肿瘤模型，实验中设置了空白对照组，CAR-T细胞单独治疗组，oHSV2溶瘤病毒单独治疗组，CAR-T细胞和oHSV2的联合治疗组。结果表明，与空白对照组相比，CAR-T在体内实验中同样具有抗肿瘤活性，溶瘤病毒oHSV2单独治疗组也能够对肿瘤的生长进行抑制。与单一给药的方式相比，oHSV2联合CAR-T细胞进行治疗能够更好缩小肿瘤的生长。 本研究表明oHSV2和CAR-T细胞的联合治疗能对实体瘤起到更好的疗效，为实体瘤的治疗提供了一个新颖的思路。

目录

声明

第1章 引言

1.1 胃癌的的研究和治疗现状

1.2 CAR-T细胞疗法的原理

1.3 CAR-T细胞疗法在肿瘤中的应用

1.3 CAR-T细胞疗法在实体瘤中面临的挑战

1.3.1靶点的选择

1.3.2 CAR-T细胞在体内的定位

1.3.3 抑制性的肿瘤微环境

1.3.4抑制性的免疫细胞

1.4 溶瘤病毒疗法

1.5立题的目的及意义

1.6 本论文的主要研究内容

第2章 靶向CD19的嵌合抗原受体的慢病毒载体制备

2.1 实验材料

2.1.1实验试剂

2.1.2实验材料

2.1.3实验仪器与设备

2.1.4培养基及试剂配置

2.1.5引物合成

2.2 plvx-acgfp1-h1928z载体构建

2.2.1 大肠杆菌感受态的制备

2.2.2 plvx-acgfp1-h1928z载体的制备

2.3 plvx-acgfp1-h1928z慢病毒载体的包装

2.3.1慢病毒包装质粒的提取

2.3.2 HEK-293T细胞的复苏与培养

2.3.3慢病毒包装

2.3.4慢病毒浓缩

2.3.5慢病毒滴度测定

2.4 Western blot检测CD19-CAR的表达

2.4.1 ICP4细胞的复苏与培养

2.4.2 脂质体LipofectamineTM 3000转染ICP4细胞

2.4.3蛋白样品的制备

2.4.4Western blot检测CD19-CAR的表达

2.5实验结果

2.5.1 plvx-acgfp1-h1928z载体构建结果

2.5.2 plvx-acgfp1-h1928z慢病毒包装结果

2.5.3 plvx-acgfp1-h1928z慢病毒滴度测定

2.5.4 ICP4细胞中plvx-acgfp1-h1928z表达结果

2.5.5Western blot检测CD19-CAR的表达

2.6本章讨论

第3章 CAR-T细胞的制备及体外活性验证

3.1 实验材料

3.1.1实验试剂

3.1.2实验材料

3.1.3实验仪器与设备

3.1.4引物合成

3.1.5培养基及试剂配置

3.2 BGC823-CD19稳转细胞系的构建

3.2.1 PBDP-CD19载体构建

3.2.2BGC823-CD19稳转细胞株的构建

3.3靶向CD19的CAR-T细胞的制备

3.3.1原代PBMC的分离

3.3.2原代T细胞的分离培养

3.3.3 CAR-T细胞的制备培养

3.3.4 T细胞活化和亚群检测

3.4 CAR-T细胞对Raji细胞的杀伤

3.4.1 Raji细胞的复苏培养

3.4.2 Raji细胞的标记

3.4.2 CAR-T细胞杀伤Raji

3.5 CAR-T细胞对Raji细胞的杀伤

3.5.1 BGC823-CD19细胞和BGC823-GFP细胞的复苏培养

3.5.2 CAR-T细胞杀伤BGC823

3.6实验结果

3.6.1 PBDP-CD19载体构建结果

3.6.2稳定表达CD19的 BGC823细胞株的筛选

3.6.3 T细胞纯度及活化检测

3.6.4 CAR-T细胞纯度及亚群鉴定

3.6.5CAR-T细胞杀伤Raji结果

3.6.6 CAR-T细胞杀伤BGC823结果

3.7本章讨论

第4章 CAR-T细胞与溶瘤病毒联合对BGC823荷瘤小鼠的治疗

4.1 实验材料

4.1.1实验试剂

4.1.2实验材料

4.1.3实验仪器与设备

4.1.4实验动物

4.2 oHSV2溶瘤病毒的生产

4.2.1 Vero细胞的复苏培养

4.2.2 oHSV2溶瘤病毒的生产

4.2.3 oHSV2溶瘤病毒的滴度测定

4.3溶瘤病毒与CAR-T联合治疗动物实验

4.3.1 BGC823-CD19细胞的复苏培养

4.3.2溶瘤病毒与CAR-T联合治疗BGC823-CD19荷瘤小鼠

4.4实验结果

4.4.1 oHSV2联合CAR-T细胞对BGC823-CD19胃癌的疗效

4.5本章结论

第5章 结论与展望

参考文献

致谢

附件1

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