PLRV 56KD蛋白基因植物转化载体的构建及对马铃薯的转化

摘要

该试验将存在于克隆载体pLR56中的马铃薯卷叶病毒56KD蛋白基因及3′端非编码区构建到双元载体系统的中间表达载体质粒pROKⅡ中,获得植物转化载体质粒pROKⅡ56,并转入根癌农杆菌LBA4404中.同时对马铃薯品种东农303、Desiree和克新4号叶片的茎段外植体再生体系进行优化.通过农杆菌介导的方法对马铃薯品种东农303进行了遗传转化,优化遗传转化系统,愈伤组织的诱导和诱导生根,适合的卡那霉素筛选浓度为50mg/L,较适宜预培养2d,菌液浓度为OD<,600>=0.2,共培养时间为2d.

目录

摘要

1前言

1.1文献综述

1.1.1植物基因工程载体的构建

1.2.1.植物抗病毒基因工程的技术路线与应用

1.2.2关于马铃薯抗卷叶病毒的研究

1.2研究的目的及意义

2实验试剂与材料

2.1.试剂

2.2.菌种和质粒

2.3.实验材料

3实验方法

3.1植物表达载体的构建

3.1.1质粒pLR56的转化与酶切鉴定

3.1.2酶切与回收

3.1.3酶连与转化

3.1.4转化菌落的快速鉴定

3.1.5亚克隆质粒pROKII 56的酶切鉴定

3.1.6转化子的PCR检测。

3.1.7将亚克隆质粒pROKII 56导入根癌农杆菌

3.1.8菌种的保存

3.2再生系统的筛选

3.2.1获得一致的基础苗

3.2.2壮苗快速繁殖

3.2.3愈伤组织与芽诱导培养基的筛选

3.3遗传转化系统的优化

3.3.1选择压力的比较

3.3.2根癌农杆菌介导的遗传转化

3.3.3 PCR检测

4结果与分析

4.1克隆质粒pLR56的酶切鉴定

4.2重组质粒pROKII 56的构建

4.2.1严谨型大质粒pROKII的提取

4.2.2质粒的酶切与连接

4.2.3重组质粒pROKII 56的鉴定

4.3根癌农杆菌的电泳检测和PCR检测

4.4再生系统的研究

4.4.1 NAA浓度对愈伤组织诱导率的影响

4.4.2不同品种外植体的成愈率(%)

4.4.3不同品种外植体的芽诱导率比较

4.4.4不同分化培养基芽诱导率的比较

4.5选择压力的确定

4.5.1愈伤组织诱导中选择压力的确定

4.5.2生根过程中选择压力的确定

4.6根癌农杆菌介导的马铃薯转化系统的优化

4.6.1预培养时间的确定

4.6.2农杆菌浓度对转化的影响

4.6.3共培养时间对转化的影响

4.6.4抗性愈伤组织的PCR检测

5讨论

5.1 56KD蛋白基因及3’端非编码区的抗病机制

5.2改善大分子质粒DNA重组效率

5.3马铃薯遗传转化中外植体的选择

6结论

参考文献

致谢

图版