NDV La Sota与V4株对鸡T细胞亚群影响及其F蛋白抗原优势表位的比较研究

摘要

该研究应用亲水性、可及性和二级结构预测等5种参数对新城疫LaSota和V4株F蛋白的B细胞抗原表位进行了综合预测;采用Margalit的AMPHI法则等3种预测方案对La Sota、V4株的F蛋白T细胞抗原表位进行了综合预测.预测到二者的F蛋白B细胞抗原表位分别有19个,T细胞抗原表位有24个.比较发现,两个毒株有9个预测的B细胞表位氨基酸序列存在差异,有11个预测的T细胞表位氨基酸序列存在差异.在此预测结果基础上,我们进行了表位的鉴定、筛选和比较研究.首先利用RT-PCR方法扩增并克隆了中国目前使用的NDV La Sota疫苗株F基因全序列,其包含了F基因完整的开放阅读框架(全长1662bp),与国外发表的La Sota疫苗株F基因核苷酸序列同源性高达99.8﹪.将两毒株F基因预测存在差异的表位,根据序列位置邻近合并分成6段表位区,以构建的La Sota疫苗株F基因和该课题保存的V4株F基因为模板,分别对每个毒株的6段表位区进行了亚克隆,构建了每个毒株的6个预测区的表达载体,对每个毒株的5个预测区进行了表达.5段多肽的大小分别是,P1:8.0KD、P2:10.8KD、P4:11.6KD、P5:13.5KD、P6:10.5KD.应用建立的Tricine缓冲体系5﹪-20﹪线性梯度聚丙烯酰胺凝胶蛋白电泳对表达情况进行了分析,证明所表达的肽段主要以包涵体形式存在,并成功地用Ni-NTA胶对其进行了纯化.分别应用自制的La Sota与V4特异性抗血清,利用Western Blot对表达的各肽段(P1-P6)进行了抗原性鉴定.结果P1、P4、P5、P6段呈阳性反应,说明其中含有线性B细胞表位.这4段分别位于F蛋白的1-48aa、201-274aa、377-458aa、469-530aa,以前发现的中和性表位均不在这4段区域内.而P2段在Western Blot中无抗体反应性,表明它不含线性表位.比较研究发现NDV La Sota与V4株的P1、P4区的B细胞表位活性存在着重要的差异,这两段分别存在于F1、F2蛋白上距离融合肽均较近的超螺旋区,这种差异可能造成两个毒株的免疫原性差异.该试验结果首次对NDV La Sota P5与V4株的细胞免疫和抗原表位差异进行了全面系统的比较研究,证实了V4疫苗株激发细胞免疫应答的功能优于La Sota,阐明了两疫苗免疫特点不同的理论基础,并初步证实产生免疫原性差异的分子基础在于抗原表位的不同,为进一步精细的研究两个毒株的抗原表位、找到二者优势抗原表位的差异,以探索二者免疫机制的不同,研制集合两毒株不同优势表位特点的表位DNA疫苗奠定了重要的基础.

目录

文摘

英文文摘

1.前言

1.1新城疫病毒的一般特征及致病的分子基础

1.1.1 NDV的分类地位

1.1.2 NDV的形态、化学组成及基因组特征

1.1.3 NDV的生物学活性

1.1.4 NDV的结构蛋白特征

1.1.5 NDV致病性及其致病的分子基础

1.1.6 NDV的基因型

1.2.抗新城疫病毒感染的免疫应答及疫苗应用现状

1.2.1鸡抗新城疫病毒免疫应答

1.2.2疫苗免疫现状

1.3抗原表位研究进展

1.3.1抗原表位概述

1.3.2 B细胞抗原表位

1.3.3 T细胞表位

2.材料与方法

2.1试验材料

2.1.1病毒

2.1.2鸡胚和鸡

2.1.3菌种与质粒

2.1.4 CD4、CD8分子单克隆抗体及FITC标记的兔抗鼠IgG

2.1.5鼠抗NDV La Sota、V4株多克隆抗体

2.1.6辣根过氧化物酶(HRP)标记的IgG抗体

2.1.7 ELISA试验用抗原及血清

2.1.8主要试剂

2.1.9主要仪器设备

2.2试验方法

2.2.1 NDV La Sota与V4株免疫鸡CD4+T、CD8+T细胞亚群动态变化比较

2.2.2 NDV La Sota、V4株F蛋白B细胞与T细胞抗原优势表位预测

2.2.3 NDV RNA的提取

2.2.4 NDV La Sota株F基因的RT-PCR扩增、克隆与序列测定

2.2.5LaSota株与V4株F蛋白抗原优势表位cDNA片段的克隆、筛选与鉴定

2.2.6小分子多肽SDS-PAGE电泳方法的建立

2.2.7 NDV La Sota、V4株F蛋白预测的抗原优势表位的表达

2.2.8表达多肽的溶解性试验

2.2.9 Ni-NTA胶纯化表达的多肽

2.2.10 Western Blot检测多肽的B细胞表位活性

2.2.11纯化多肽的免疫原性及T细胞表位活性检测

3.试验结果

3.1NDV La Sota 与V4株免疫及免疫攻毒鸡CD4+T、CD8+T细胞亚群动态变化比较

3.1.1 SPF鸡外周血和脾脏中CD4+T、CD8+T细胞动态变化

3.1.2 La Sota、V4免疫及攻毒鸡外周血中CD4+T细胞数量变化

3.1.3 La Sota、V4免疫及攻毒鸡脾脏中CD4+T细胞数量变化

3.1.4 La Sota、V4免疫及攻毒鸡外周血中CD8+T细胞的变化

3.1.5 La Sota、V4免疫及攻毒鸡脾脏中CD8+T细胞数量变化

3.2新城疫La Sota与V4株F蛋白B细胞抗原表位、T细胞抗原表位预测分析

3.3 NDV La Sota株F基因的RT-PCR扩增与克隆

3.4 NDV LaSota株与V4株F蛋白预测抗原表位cDNA的克隆与筛选

3.5小分子多肽SDS-PAGE电泳分析方法的建立

3.5.1胶配制方法及电泳缓冲体系的确立

3.5.2电泳上样量确立

3.5.3电泳条件的确立

3.5.4染色条件的确定

3.6 NDV La Sota、V4株F蛋白预测的抗原优势表位的表达

3.7表达多肽的溶解性试验

3.8 Ni-NTA胶对表达多肽的纯化结果

3.9多肽的B细胞表位活性检测结果

3.10纯化多肽免疫原性的检测

3-11 IFN-γmRNA表达量的检测

4.讨论

4.1NDV La Sota与V4株免疫及免疫攻毒鸡CD4+T、CD8+T细胞亚群动态变化比较

4.2新城疫La Sota与V4株F蛋白B细胞抗原表位、T细胞抗原表位的预测分析

4.3 NDV La Sota株与V4株F蛋白抗原优势表位cDNA的克隆与筛选

4.4小分子多肽SDS-PAGE电泳分析方法的建立

4.5 NDV La Sota株与V4株F蛋白抗原优势表位的表达、纯化与抗原性鉴定

4.6 La Sota P5、V4 P5纯化多肽的免疫原性初步研究

4.7 La Sota P5、V4 P5纯化多肽的T细胞表位活性检测

5.结论

参考文献

附录A 试验所用试剂的配制

附录B 试验用V4 F基因的核苷酸序列

致谢

作者简介

攻读学位期间发表文章情况