鹅细小病毒VP3基因的克隆、序列比较及原核表达

摘要

鹅细小病毒(Goose Parvovirus,GPV)为细小病毒科细小病毒属成员,它引起雏鹅发生以急性肠炎及肝、肾、心实质器官炎症为特征的烈性传染病-小鹅瘟.GPV致病性强,所致疾病死率高,对养鹅业的危害严重.中国学者方定-1956年首先发现了本病,并分离出GPV.在此之后,国外许多国家相继分离到该病毒,证实了该病毒在世界范围内有较为广泛的分布.VP3为GPV的主要结构蛋白,占病毒结构蛋白的80％,是主要免疫保护性抗原.因此,对VP3基因及其产物的研究对小鹅瘟的防制有重要理论价值和实践意义.该实验根据Zadori等发表的GPV B株基因序列合成了扩增GPV主要结构蛋白VP3基因的上下游引物GF\GR.利用这对引物,分别将来自国内的4个GPV毒株,通过PCR技术从病毒基因组DNA中扩增出病毒VP3完整基因片段,将之与pMD18-T质粒载体连接,转化感受态大肠杆菌TG1,提取重组质粒经PCR鉴定和酶切鉴定后,对插入片段进行序列测定及比较分析.序列测定结果为:4个GPV毒株的VP3基因全长均为1605bp,编码534个氨基酸.序列分析比较表明,不同毒株VP3基因同源性较高(95.64％~99.81％),而强弱毒株之间有5个氨基酸存在共性差别.另设计一对带有酶切位点的PCR扩增引物,对其中1株GPV的VP3基因重新进行了PCR扩增,并将PCR产物克隆到pMD18-T质粒载体.经酶切鉴定和序列测定后,再将带有粘性末端的VP3基因片段亚克隆到pGEX表达载体系统的pGEX-6p-1质粒,构建了原核表达载体pGEX-6p-VP3.将pGEX-6p-VP3再转化表达宿主BL21(DE3)plysS,经IPTG诱导,成功地表达了带有融合蛋白GST的VP3(GST-VP3).SDS-PAGE分析表明,利用pGEX表达载体系统所表达的GST-VP3,分子质量约为88ku,其中VP3约为58ku.该实验在基因和分子水平上说明了VP3基因的保守性和GPV单一血清型的分子生物学基础,并为进一步研究VP3蛋白的理化特性和分子生物学特性提供了必要的条件.这为确立GPV的分类地位及其进化关系的研究提供了依据,同时为研制GPV基因工程疫苗和分子诊断试剂奠定了坚实的工作基础.

目录

文摘

英文文摘

1引言

1.1GPV的形态和理化学特性

1.2GPV的培养特性

1.3GPV基因组的结构

1.4GPV的转录与复制

1.5GPV基因编码的蛋白

1.5.1 GPV的结构蛋白

1.5.2 GPV的非结构蛋白

1.6GPV与其他细小病毒的关系

1.6.1 GPV与细小病毒成员的关系

1.6.2 GPV与依赖病毒AAV的关系

1.6.3 GPV与红病毒属成员的关系

1.7GPV的诊断

1.7.1 GPV的临床诊断

1.7.2实验室诊断

1.8GPV分子生物学研究的意义

2材料与方法

2.1试验材料

2.1.1病毒

2.1.2质粒与菌种克隆载体

2.1.3引物

2.1.4主要试剂

2.1.5主要仪器

2.2试验方法

2.2.1 GPV主要结构蛋白VP3基因的克隆

2.2.2 PCR产物的克隆与鉴定

2.2.3 VP3基因的原核表达

2.2.4 VP3基因的表达和SDS-PAGE分析

3结果

3.1.4株GPV毒株VP3基因PCR结果

3.2重组子酶切鉴定结果

3.3.4株GPV VP3基因测序结果及序列比较

3.4 表达载体构建及鉴定的结果

3.5重组质粒PEGX-6P-VP3在BL21(DE3)plysS中的表达

4讨论

4.1.4株鹅细小病毒VP3基因的比较

4.2 GPV VP3基因的原核表达

5结论

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

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