黑龙江省部分地区PED流行特征及病毒生物学特性研究

摘要

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemic diarrhea virus,PEDV)引起的以腹泻、呕吐和脱水为主要临床特征的猪消化道传染病.该病在我国及世界各养猪国家广泛分布,其对仔猪的危害严重,致死率高.该实验对黑龙江省不同地区的5个腹泻病发生的猪场经临床初步诊断、实验室PCR技术和病原分离,确诊其中的两个猪场为猪流行性腹泻.证明了黑龙江地区存在有猪流行性腹泻.这两个养猪场哺乳仔猪发病率为72.6％和89.95％,其他年龄猪为68.07％和75％;哺乳仔猪死亡率为62.88％和81.31％;其他年龄猪为8.31％和10.37％;从发病年龄看,虽然各种年龄的猪均有发生,但死亡多在4周龄以下哺乳仔猪;发病季节均为冬春寒冷季节,临床表现以水样或稀薄黄白色腹泻为主要特征.该实验对PCR阳性的腹泻粪便样品进行了病毒分离.粪便毒在Vero细胞上进行连续盲传,现已传20代次.在17代之前,感染细胞无明显变化,在传至18代时,表现为细胞轮廓不清,细胞颗粒增多,培养液中死亡细胞增多.并以每隔5个代次采用RT-nestedPCR技术检测PEDV M基因,结果表明,在第5、10、15和20等不同代次的细胞培养物进行的Nested-PCR均为阳性结果,说明分离毒确已在细胞中得到了稳定生长.该细胞适应病毒的获得为我国PEDV地方分离株血清学、免疫学、病原生物学以及疫苗研制等提供了重要的物质基础.该研究根据Genebank中PEDV CV777和Br1/87 M基因的保守序列设计引物,通过RT-PCR和Nested-PCR方法在中国首次从患病猪的粪便中扩增获得了中国地方株LJB/03 M全基因序列.将其插入克隆载体质粒pMD18-T,并进行测序.测序结果显示LJB/03株M基因核苷酸序列全长681bp,含有完整的开放阅读框架,编码226个氨基酸,将其核苷酸序列及推导的氨基酸序列与已发表Br1/87和CV777两个国外同源标准毒株M基因进行比较,核苷酸序列与Br1/87比较分别在37、47、138、179、192、213、269、285、348、448、579、597、618、629等14个核苷酸存在差异,同源性为97.94％;与CV777比较分别在37、47、138、179、192、213、269、285、348、579、597、618、629等13个核苷酸存在差异,同源性为98.09％;推导的氨基酸序列与Br1/87株和CV777株M基因相比,分别有5个和4个氨基酸差异,同源性分别为97.79％和98.23％,而CV777和Br1/87 M基因之间核苷酸序列仅有1个核苷酸不同,同源性99.85％,推导的氨基酸序列同源性99.56％.因此LJB/03株与CV777和Br1/87 M基因存在一定变异.

目录

文摘

英文文摘

1前言

1.1猪流行性腹泻流行病学与诊断研究概况

1.1.1猪流行性腹泻在不同国家的流行概况

1.1.2猪流行性腹泻诊断方法研究概况

1.2猪流行性腹泻病毒的生物学特性研究进展

1.2.1病毒形态特征及理化特性

1.2.2病毒培养特性

1.2.3基因组结构

1.2.4主要结构蛋白及其功能

1.2.5PEDV与其他冠状病毒的抗原相关性

1.3本研究的目的意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1 病料

2.1.2病毒与细胞

2.1.3质粒与菌种

2.1.4实验中用到的引物

2.1.5试剂

2.1.6试验主要仪器设备

2.2实验方法

2.2.1黑龙江省部分地区猪流行性腹泻流行病学调查

2.2.2临床诊断方法

2.2.3实验室诊断方法

2.2.4PEDV M基因PCR产物目的片段的克隆与鉴定

2.2.5阳性重组子序列测定及同源性比较

2.2.6PEDV病毒的分离培养

3结果

3.1黑龙江省部分地区5个腹泻病发生猪场流行情况调查结果

3.2PEDV实验室诊断结果

3.3PEDV LJB/03株M基因的克隆和酶切PCR鉴定

3.4PEDV LJB/03株M基因的序列测定及同源性分析

3.4.1 LJB/03株M基因的序列测定结果

3.4.2 LJB/03株M基因的序列比较分析结果

3.5PEDV LJB/03株在Vero细胞上的繁殖

3.5.1PEDV LJB/03株在Vero细胞上的致病变特性

3.5.2地方株LJB/03在细胞上盲传各代次M基因PCR检测结果

4讨论

4.1猪流行性腹泻在不同地区流行特征存在差异

4.2PEDV LJB/03分离株在Vero细胞上的培养特性

4.3PEDV LJB/03株M基因的序列分析

5结论

参考文献

攻读硕士学位期间发表的论文

致 谢