口蹄疫病毒基因植物表达载体的构建及其对大豆的遗传转化

摘要

利用植物生物反应器生产口服疫苗已成为目前研究的热点.与传统疫苗相比,植物源性疫苗具有安全、稳定、高效和廉价等优点.植物作为生产疫苗的载体可将抗原表达于植物的可食部位(例如种子和块茎).当植物被食用或饲喂时,植物源性疫苗可激发保护性的黏膜免疫反应.随着生物技术的不断完善,植物生物反应器将会成为疫苗生产的有效途径,并部分替代传统疫苗的生产方式.口蹄疫(Foot and Mouth Disease)是一种高发性流行传染病,常在国际间大规模爆发,目前尚无治愈本病的药物,现在使用较广泛的是酵母源性疫苗.因为酵母源性疫苗生产成本较高,贮运过程中需要低温,注射接种需要特定设备而限制了它的应用.利用转基因植物生产植物源性的口蹄疫疫苗前景广阔.目前,口蹄疫病毒基因(FMDV)已经导入马铃薯、烟草和苜蓿等植物,有关口蹄疫病毒基因导入大豆中的研究未见报道.根据口蹄疫病毒基因序列FP1(包括FVP1,实验操作与FP1相同)设计引物,同时引入酶切位点BamHI和SaLI.通过PCR反应从pGEM-FP1载体上扩增FP1基因,并插入pUCM-T载体构建成pUCM-FP1中间载体.PCR和酶切鉴定正确的克隆进行测序,序列分析结果表明,插入目标序列完全正确.用BamHI和SaLI同时酶切pUCM-FP1中间载体和植物组成型表达载体pBin438,构建成植物表达载体pBin-FP1.热激法转化大肠杆菌JM109.经过PCR和酶切鉴定正确的克隆转化根癌农杆菌GV3101,成功构建了2个载体,分别命名为pBin-FP1、pBin-FVP1.用携带此表达载体的根癌农杆菌GV3101侵染大豆.通过农杆菌介导的大豆子叶节再生体系转化大豆.采用从发芽5-7d的大豆无菌苗切取子叶节外植体,经农杆菌浸染和3d的共培养后,转移到芽诱导培养基上,10d后从子叶节处诱导出丛生芽.在含50μg/ml卡那霉素的伸长培养基上培养2周后,抗性芽转入生根培养基进行培养,共得到51株卡那抗性植株.28株移栽成活的T<,0>代植株已正常开花和结荚,经PCR检测获得目的基因的阳性植株15株.初步验证了目的基因已整合到大豆基因组中.

目录

文摘

英文文摘

1前言

1.1研究的目的与意义

1.2研究动态

1.2.1生物反应器

1.2.2口蹄疫病毒疫苗的研究进展

1.2.3农杆菌转化大豆子叶节高效再生体系

1.3本研究的技术路线

2材料与方法

2.1材料

2.1.1试材

2.1.2仪器

2.1.3主要试剂和药品

2.1.4所用的几种培养基的成分

2.2实验方法

2.2.1 DNA的提取

2.2.2 PCR扩增

2.2.3 DNA片段的回收

2.2.4限制性内切酶酶切反应

2.2.5连接反应

2.2.6感受态细胞的制备及宿主细胞的转化

2.2.7农杆菌介导的大豆子叶节再生体系

3结果与分析

3.1 pGEM-FVP1和pGEM-FP1质粒的提取及鉴定

3.2目的基因的PCR扩增

3.3 pUCM-FVP1和pUCM-FP1中间载体的构建

3.3.1 pUCM-FVP1重组子的检测

3.3.2 pUCM-FP1重组子的检测

3.4植物表达载体pBin-FVP1和pBin-FP1的构建

3.4.1 pBin-FVP1的PCR和酶切鉴定

3.4.2 pBin-FP1重组子的PCR和酶切鉴定

3.5植物表达载体pBin-FVP1、pBin-FP1转化农杆菌

3.6口蹄疫病毒基因向大豆的遗传转化

3.6.1遗传转化过程中大豆不同基因型的影响

3.6.2大豆的转化与植株的再生

3.6.3再生植株的PCR检测

4讨论

4.1不对称相容末端连接法构建表达载体

4.2疫苗受体植物的选择和安全性评价

4.3大豆子叶节再生体系的优化

4.4再生植株的PCR检测

4.5需要进一步解决的问题

5结论

5.1构建了中间表达载体

5.2构建了口蹄疫病毒基因的植物表达载体

5.3农杆菌介导的大豆子叶节再生体系获得PCR阳性植株

参考文献

图版说明

附录

附录1：FP1的序列(2208bp)

附录2：FVP1的序列(639bp)

附录3：FP1序列的测序结果(pUCM-FP1 as the sample)

附录4：FVP1序列的测序结果(pUCM-FVP1 as the sample)

附录5：本实验所用的DNA Markers

攻读硕士学位期间发表的学术论文

致谢