猪卵母细胞和早期胚胎中c-mos和Oct-4基因表达以及RNAi研究

摘要

本文对猪卵母细胞和早期胚胎中c-mos和Oct-4基因表达以及RNAi进行了研究。主要内容及结果如下： 1.三种猪卵母细胞透明带去除试剂中蛋白酶K(PK)处理后在存活率和质膜完整状况上好于蛋白酶E(PE)，比酸性台式液(A-TYR)作用效果更为温和，易于操作，是最好的选择。孤雌激活ZPF卵母细胞时选取110V电压为最高激活电压，以20V为电压梯度设110V，90V，70V，50V和30V 5个实验组和一个0V对照组，50V电压下卵裂情况最好，90V电压下囊胚发育情况最好。 2.采用Neighbor-Joining算法对MOS和Oct-4蛋白进行分子进化分析。两种蛋白的分子进化关系都符合物种进化规律，且功能保守。Oct-4同源蛋白在无脊椎和脊椎动物中存在，但在禽类分支中没有发现。 3.猪卵母细胞在成熟之前mRNA量持续增加，激活后6h mRNA水平下降到体外培养0h卵母细胞的0.203±0.15倍，直到2-细胞胚胎期仍保持降低趋势。 4.siMOS1311序列只有在最高浓度组200uM能有效干扰c-mos基因表达：siMOS1171在0.2nM和200uM能有效干扰c-mos基因表达，而在中间浓度组0.2uM却不能有效干扰，无浓度依赖性关系。

目录

文摘

英文文摘

声明

1引言

1.1哺乳动物卵母细胞和早期胚胎生长发育

1.1.1哺乳动物卵母细胞的生长和成熟

1.1.2哺乳动物早期胚胎的发育

1.2 c-mos基因的表达以及功能

1.2.1 c-mos基因的表达及调控

1.2.2卵母细胞中MOS作用

1.2.3 MOS在精子发生过程中的表达和作用

1.2.4 MOS激酶途径以及核心分子MAPK

1.3 Oct-4基因的表达以及功能

1.3.1 Oct-4在哺乳动物早期胚胎中的表达和调控

1.3.2 Oct-4与细胞分化

1.3.3 Oct-4与全能性调节

1.3.4 Oct-4因子的功能实现

1.3.5 Oct-4在低等动物中有同源基因

1.3.6 Oct-4和体细胞克隆

1.3.7 Oct-4和癌症

1.3.8 Oct-4基因在基础研究和医学研究中的应用

1.4哺乳动物RNAi机制以及RNAi在卵母细胞和早期胚胎中应用

1.4.1哺乳动物的RNAi

1.4.2 RNAi在哺乳动物卵母细胞及早期胚胎发育研究中的应用

1.5去透明带卵母细胞的研究和应用

1.6本研究的目的意义

2材料与方法

2.1猪卵母细胞和孤雌胚胎的获得和体外培养

2.1.1卵母细胞的采集和成熟培养

2.1.2卵母细胞的激活和孤雌卵母细胞的培养

2.2对猪卵母细胞的去卵丘和去透明带处理

2.2.1去卵丘处理

2.2.2不同去透明带试剂的配制

2.2.3去透明带处理

2.3无透明带卵母细胞成熟培养、孤雌激活和无透明带孤雌胚胎体外培养

2.3.1无透明带卵母细胞的成熟培养

2.3.2无透明带卵母细胞的孤雌激活

2.3.3无透明带孤雌胚胎的体外培养

2.4猪卵母细胞和早期胚胎总RNA的提取

2.4.1卵母细胞和胚胎材料处理和保存

2.4.2总RNA的提取和保存

2.4.3提取RNA的质量检测

2.5反转录PCR和反转录实时定量PCR(Realtime PCR)

2.5.1反转录PCR

2.5.2反转录Realtime PCR

2.5.3定量PCR引物的设计和序列合成

2.5.4 Realtime PCR结果分析方法

2.6激光共聚焦显微镜检测免疫荧光实验

2.6.1液体的准备

2.6.2抗体的分装和储存

2.6.3免疫荧光染色步骤

2.6.4装片

2.6.5激光共聚焦显微镜观察

2.6.6卵母细胞核的分型

2.6.7 MOS蛋白的检测时间

2.7胚胎细胞数的检测

2.7.1自发孤雌激活早期胚胎细胞数目检测

2.7.2囊胚细胞数检测

2.8 siRNA RNA干扰体系

2.8.1 siRNA设计和序列合成

2.8.2干扰序列的注射

2.8.3注射效率的检测

2.9数据分析和图表制作

3结果与分析

3.1猪卵母细胞透明带去除方法建立及去透明带后激活电压摸索

3.1.1不同试剂去除透明带效果比较

3.1.2不同电压电激活后对无透明(ZPF)带卵母细胞后期发育影响

3.2 MOS和Oct-4蛋白功能结构域分析和系统发生分析

3.2.1猪MOS的功能结构域分析

3.2.2 c-mos基因的系统发生分析

3.2.3 Oct-4蛋白的功能结构域分析

3.2.4 Oct-4基因的系统发生分析

3.3 c-mos基因表达和RNAi

3.3.1 c-mos基因表达

3.3.2 c-mos基因的RNAi

3.4 Oct-4基因的表达和RNAi

3.4.1 Oct-4基因表达

3.4.2 Oct-4基因的RNAi

3.5猪卵母细胞中母源基因表达产物siRNA RNAi体系特性

3.5.1序列注射对卵母细胞发育的影响

3.5.2不同时期卵母细胞注射效率试验

3.5.3不同浓度干扰序列的干扰效果

3.5.4不同RNAi反应时间的干扰效果

4讨论

4.1猪卵母细胞透明带去除方法建立及无透明带卵母细胞激活条件摸索

4.1.1关于不同试剂处理后去除透明带效果的评价

4.1.2关于WOW培养方法及其改进

4.1.3不同电压电激活后对ZPF孤雌胚发育的影响

4.2 c-mos基因和Oct-4基因系统发生分析

4.2.1关于Neighbor-Joining算法构建系统进化树

4.2.2 c-mos基因的系统发生分析

4.2.3 Oct-4基因的系统发生分析

4.3 c-mos基因与Oct-4基因的表达和RNAi

4.3.1关于Realtime PCR

4.3.2猪卵母细胞体外成熟前后c-mos基因mRNA水平变化

4.3.3猪卵母细胞体外成熟前后MOS表达和分布变化

4.3.4 c-mos基因干扰效果

4.3.5 Oct-4基因表达和RNAi

4.3.6关于siRNA的设计

4.3.7 siRNA效应分子RNAi方法研究卵母细胞中的功能基因

4.4猪卵母细胞中RNAi特点

4.4.2不同浓度干扰序列的干扰效果

4.4.3 RNAi反应对时间的依赖性

4.4.4干扰序列注射时间的选择

4.4.5关于注射效率和干扰效率

4.4.6猪卵母细胞进行RNAi的优势

5结论

致谢

参考文献

附录

博士期间发表的文章