大豆线粒体细胞色素氧化酶基因分离及序列分析

摘要

随着水稻、玉米等主要农作物杂种优势利用的成功，大豆已成为少数几个没有大规模利用杂种优势的主要作物之一，其主要原因是没有适于杂交种生产的不育系。自从1993年吉林省农科院孙寰等发现世界上第一个大豆细胞质雄性不育系以来，该领域的研究和应用迅速发展，但是对其细胞质雄性不育的分子机理研究尚属空白。 目前，国内外关于细胞质雄性不育的机理研究主要集中在植物线粒体上。植物线粒体基因组中，编码蛋白质的基因有cox、3个细胞色素氧化酶复合物的大亚单位Cox Ⅰ、CoxⅡ和CoxⅢ的基因，F0-FlATPase复合物的4个亚单位基因，核糖体蛋白小亚单位rps4、rpsl3、rps14以及编码NADH-辅酶Q氧化还原酶复合物的几个亚单位基因；另外，还有线粒体蛋白自身合成系统中的3个rRNA(5S、18S和26S)基因和一些tRNA基因。除上述编码基因外，线粒体基因组中还含有一些功能未知的开放阅读框(0RF)，并存在大量的非编码序列。 线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅱ(Cox Ⅱ)、亚基Ⅲ(CoxⅢ)是植物呼吸作用中还原氧到水分子的重要酶系统成员。目前，已经发现在玉米、矮牵牛、水稻、小麦、高粱、油菜等细胞质雄性不育系中CoxⅠ、Cox Ⅱ、CoxⅢ、atp6、atp9、atpA、cob等与线粒体能量代谢的相关基因在基因编码区域、基因组织结构或拷贝数等方面与正常可育保持系有明显差异，因此推测这些基因可能与CMS有关。 本实验通过参考大豆线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅱ基因和亚基Ⅲ基因序列，设计并合成保守基因引物，首次从吉林省农业科学院特有的大豆细胞质不育系和保持系材料的线粒体基因组中扩增得到这两个基因，并对基因序列做了初步的分析。主要结果如下： 1．采用了DNase Ⅰ消化法和蔗糖不连续密度梯度水平超速离心相结合的方法提取了高质量、高纯度的大豆线粒体DNA。 2．建立稳定的大豆线粒体基因组DNA PCR扩增体系。 3．根据GenBank中登录的大豆细胞质氧化酶亚基Ⅱ基因序列，合成保守引物，从吉林省农业科学院特有的大豆细胞质不育系和保持系线粒体基因组中扩增得到两个细胞色素氧化酶亚基Ⅱ基因，该基因编码了一个由280个氨基酸组成的蛋白。 4．由于克隆的亚基Ⅱ基因序列高度同源且只在供试材料的保持系中克隆到了这个基因，这表明该基因可能与大豆细胞质雄性不育有关系。 5．根据GenBank中登录的大豆细胞质氧化酶亚基Ⅲ基因序列，合成保守引物，从吉林省农业科学院特有的大豆细胞质不育系和保持系线粒体基因组中扩增得到细胞色素氧化酶亚基Ⅲ基因，该基因编码了一个由213个氨基酸组成的蛋白。 6．由于所克隆的四个细胞色素氧化酶亚基Ⅲ基因序列高度同源，这表明该基因可能与大豆细胞质雄性不育没有直接的关系。有关大豆细胞质雄性不育的分子机理还有待于进一步的线粒体功能基因组学来揭示。

目录

文摘

英文文摘

声明

1引言

1.1植物雄性不育概述

1.1.1细胞质雄性不育与杂种优势

1.1.2大豆细胞质雄性不育

1.2植物细胞质雄性不育与线粒体基因组

1.2.1植物线粒体基因组

1.3植物基因克隆的方法和策略

1.3.1已知基因的表达产物克隆植物基因的方法

1.3.2未知基因的表达产物克隆植物基因的方法

1.3.3已知基因的序列克隆植物基因的方法

1.4研究的目的与意义

1.5研究的主要内容

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1生物材料

2.1.2酶及试剂

2.1.3主要仪器

2.1.4细菌培养基

2.1.5引物清单

2.2实验方法

2.2.1大豆黄化苗的培育

2.2.2大豆线粒体DNA的提取和纯化

2.2.3线粒体DNA的质量分析

2.2.4 PCR反应体系及反应程序

2.2.5 PCR扩增产物的回收

2.2.6回收产物的克隆

2.2.7大肠杆菌感受态细胞的制备

2.2.8质粒DNA提取

2.2.9重组质粒酶切及PCR鉴定

2.2.10测序

2.2.11序列的生物信息学分析

3结果与分析

3.1高质量线粒体DNA的制备

3.2大豆线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅱ基因克隆及序列分析

3.2.1 PCR扩增及电泳检测

3.2.2 T-A克隆、酶切及PCR鉴定

3.2.3测序及序列分析

3.3大豆线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅱ基因克隆及序列分析

3.3.1 PCR扩增及电泳检测

3.3.2 T-A克隆、酶切及PCR鉴定

3.3.3测序及序列分析

4讨论

4.1高质量大豆线粒体DNA的制备

4.2大豆线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅱ基因

4.3大豆线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅲ基因

5结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文