MDRV S基因组序列分析及σC-ELISA诊断方法的建立

摘要

本研究对番鸭呼肠孤病毒S12和S14毒株S基因组(S1.4)s A/s B/s NS/s C的编码基因进行了克隆和测序。序列分析表明：DRV与ARV的s A/s NS编码基因的核苷酸同源性分别为76.0％～77.1％和78.4％～79.6％，氨基酸同源性分别为89.5％～91.2％和91.6％～92.7％；而具有诱导群特异性和型特异性中和抗体的s B/s C编码基因的核苷酸同源性分别为60.3％～64.4％和2.7％～9.9％，氨基酸同源性分别为61.4％～62.0％和22.6％～26.7％;DRV和ARV抗原性存在差异。而DRV S12/S14与法国89026株s A/s B/s NS/s C编码基因的核苷酸同源性分别为90.0％、93.6％、87.9％～88.0％和93.1％，氨基酸同源性分别为97.1％、94.3％、95.7％～95.9％和93.7％。进化分析表明：DRV与ARV形成不同的分支，DRV在正呼肠孤病毒属中是不同于ARV的一种新的呼肠孤病毒。 同时，本研究将编码外壳蛋白σ C的基因克隆于原核表达载体pET32a上，经过EcoR I和Sac Ⅰ双酶切鉴定和序列分析后，得到阳性重组质粒pET32a-σ C；将阳性重组质粒pET32a-σ C转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中进行诱导表达，经SDS-PAGE和Western-blbtting检测分析，融合表达的蛋白能够与番鸭呼肠孤病毒感染的康复鸭血清发生特异性反应；将融合表达的蛋白纯化后作为包被抗原，建立了检测鸭血清中呼肠孤病毒抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法，此方法中抗原的最佳包被浓度为5μg/ml、标准阳性血清的最适稀释倍数为1：40倍，用此方法对50份鸭血清样品进行检测，并与琼脂糖凝胶扩散试验检测抗体的法相比较，证明此ELISA方法具有良好的特异性和敏感性，本研究为今后鸭呼肠孤病毒诊断试剂盒的研制奠定了基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

1引言

1.1呼肠孤病毒的研究现状

1.1.1呼肠孤病毒科简介

1.1.2禽呼肠孤病毒简介

1.1.3番鸭呼肠孤病毒的研究现状

1.2免疫酶技术的研究进展

1.2.1发展史

1.2.2免疫酶技术的分类

1.2.3免疫酶技术的原理

1.2.4酶结合物研究进展

1.2.5酶免疫技术的应用

1.3本研究的目的和意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1病毒

2.1.2实验动物

2.1.3血清

2.1.4主要试剂

2.1.5溶液配制

2.1.6引物

2.1.7主要仪器

2.2实验方法

2.2.1病毒的增殖及RNA的提取

2.2.2病毒RNA反转录合成cDNA

2.2.3 PCR扩增目的基因

2.2.4 PCR产物的回收和纯化

2.2.5 PCR产物的克隆

2.2.6序列分析

2.2.7 sC基因的原核表达

2.2.8表达产物sC蛋白的生物学活性检测

2.2.9 sC重组蛋白的提取及纯化

2.2.10蛋白浓度的测定及保存

2.2.11纯化蛋白的检测

2.2.12间接ELISA操作程序

2.2.13 s C-ELISA检测方法的初步建立

2.2.14 s C-ELISA敏感性试验

2.2.15 s C-ELISA特异性试验

2.2.16 s C-ELISA的应用

3结果与分析

3.1 RT-PCR扩增及鉴定结果

3.1.1 S组基因RT-PCR扩增结果

3.1.2用于原核表达的sC基因RT-PCR扩增及鉴定结果

3.2 s A/s B/s NS/s C编码基因序列分析

3.3 DRV和其它正呼肠孤病毒的系统进化关系

3.4表达载体的构建及鉴定结果

3.5表达蛋白的SDS-PAGE和Western Blotting分析

3.6纯化蛋白的SDS-PAGE及Western-blotting检测

3.7 s C-ELISA检测方法的初步建立结果

3.7.1最适封闭液及封闭时间的确定

3.7.2抗原最佳包被浓度的确定

3.7.3最佳血清稀释度及工作时间的确定

3.7.4酶标二抗最佳作用时间的确定

3.7.5间接ELISA最佳显色时间的确定

3.8 s C-ELISA敏感性试验结果

3.9间接ELISA特异性试验结果

3.10 s C-ELISA的应用结果

4讨论

5结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文