耐盐野生大豆DREB类转录因子基因的克隆与分析

摘要

低温、干旱、盐碱等逆境条件严重影响作物的产量和质量，是全球农业生产亟待解决的重大问题。通过基因工程手段改良植物的抗逆性是提高作物产量的有效途径之一。而如何利用抗逆基因资源，从大量的渗透胁迫响应基因中寻找到能够综合性提高作物抗逆性的基因，是植物渗透胁迫基因工程的重要前提。转录因子在植物逆境信号传递过程中发挥着关键作用，一个转录因子可以同时调控多个下游基因的表达，从而提高植物的抗逆性。 耐盐野生大豆具有丰富的抗逆基因资源，是基因克隆的理想材料。本研究以耐盐野生大豆为试材，通过电子克隆、同源克隆、酵母单杂交方法克隆DREB(Dehydration。ResponsiveElement-Bindingprotein)类转录因子基因；利用生物信息学手段预测基因的结构、并对获得的全长DREB转录因子基因做进化分析；应用同酵母单杂交系统对获得的DREB类转录因子基因进行体内结合特异性分析，同时比较其与DRE顺式作用元件结合能力的强弱。为野生大豆中DREB类转录因子基因的功能研究及其在植物抗渗透胁迫基因工程中的应用奠定基础。主要研究内容如下： 1.电子克隆方法克隆GsDREB1基因应用电子克隆技术在耐盐野生大豆中克隆了1个DREB类转录因子基因，与GmDREB1基因序列相似性达到99.71％，命名为GsDREB1。经SMART和InterProScan预测表明，GsDREB1基因含有AP2结构域。 2.同源克隆方法克隆DREB类转录因子基因应用同源克隆方法在耐盐野生大豆中克隆了5个DREB类转录因子基因，分别命名为GsDREBa、GsDREBb，GsDREBc，GsDREB2、GsDREB3。分别将各条基因进行序列比对，比对结果为：GsDREBc与GmDREBc的相似性为99.33％；GsDREBb与GmDREBb的相似性为97.44％；GsDREBa与GmDREBa与的相似性为93.08％；GsDREB2与GmDREB2的相似性为95.60％：GsDREB3与GmDREB3的相似性为100.00％。SMART和InterProScan预测结果表明这5个基因都含有AP2结构域。 3.酵母单杂交方法克隆与DRE顺式作用元件结合的转录因子基因将耐盐野生大豆幼苗进行胁迫处理，构建cDNA融合文库。以DRE元件为“诱饵”，应用酵母单杂交方法克隆DREB类转录因子。从A52号克隆中得到了一条232bp的片段，这个片段不含有起始密码子和终止密码子，经SMART预测此片段含有AP2结构域。5’RACE延伸出了198bp，但这198bp在三种读码方式下都含有终止密码子。 4.DREB类转录因子基因体内结合特异性分析经SMART预测，获得6个DREB基因的AP2结构域序列。应用Clastalx1.83软件将6个基因的结构域进行比对，结果表明6个基因结构域序列都具有典型的AP2结构域特征。PCR扩增6个基因保守结构域，并在保守结构域和A52克隆两端引入同源重组位点。应用酵母单杂交系统分析6个基因结构域的体内结合特异性，同时将转化混合物涂布在含有不同浓度3-AT的三缺SD培养基上，比较它们与DRE顺式作用元件结合能力的强弱。结果表明GsDREBa，GsDREBb，GsDREBc、GsDREB1，GsDREB2、GsDREB3都能够与DRE元件发生特异性结合，且与DRE顺式作用元件结合能力相当。但A52克隆的结合力较其它6个基因弱很多。 5.DREB类转录因子基因的进化分析应用DNAstar软件对GsDREBa、GsDREBb、GsDREBc、GsDREB1、GsDREB2、GsDREB36个基因进行进化分析。进化树直观的表明GsDREBJ与GxDREB2聚为一类；GsDREBa与GsDREBc聚为一类；GsDREBb与GsDREB3聚为一类。6个基因与祖先的远近关系为GsDREBb＞GsDREBa＞GsDREBc＞GsDREB1＞GsDREB2=GsDREB3。

目录

文摘

英文文摘

声明

1引言

1.1研究目的和意义

1.2国内外文献综述

1.2.1野生大豆耐盐性研究进展

1.2.2渗透胁迫相关转录因子的研究现状

1.2.3生物信息手段在基因克隆中的应用

1.2.4酵母单杂交技术在转录因子研究中的应用

1.3本研究的研究内容

2材料与方法

2.1材料

2.1.1菌株和质粒

2.1.2植物材料

2.1.3试剂

2.1.4培养基

2.1.5仪器

2.2方法

2.2.1电子克隆方法克隆耐盐野生大豆DREB基因

2.2.2同源克隆方法克隆耐盐野生大豆DREB基因

2.2.3酵母单杂交方法克隆耐盐野生大豆DREB基因

2.2.4DREB转录因子基因体内结合特异性分析

2.2.5克隆的6个DREB基因的进化分析

3结果与分析

3.1电子克隆方法克隆耐盐野生大豆DREB基因

3.1.1GsDREB1基因的电子克隆

3.1.2RT-PCR验证试验

3.2同源克隆方法克隆耐盐野生大豆DREB基因

3.2.1PCR扩增目的片段

3.2.2测序结果分析

3.3酵母单杂交方法克隆耐盐野生大豆DREB基因

3.3.1耐盐野生大豆cDNA文库的构建

3.3.2诱饵质粒3-AT抑制浓度的确定

3.3.3共转化酵母Y187

3.3.4阳性克隆的筛选

3.3.5阳性克隆测序结果的分析

3.3.6A52克隆全长序列的获得

3.4DREB转录因子基因体内结合特异性分析

3.4.1DREB转录因子基因结构域的分析

3.4.2PCR扩增DREB转录因子基因的结构域

3.4.3pGADT7-Rec2文库载体质粒的提取及线性化

3.4.4酵母感受态细胞的制备及转化

3.5克隆的6个DREB基因的进化分析

4讨论

5结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文