分子佐剂C3d增强猪流感病毒HA-DNA疫苗免疫原性的研究

摘要

猪流感(SI)是由猪流感病毒(SIV)引起的一种急性高度传染性呼吸道疾病。目前，包括H1N1、H3N2和H1N2亚型在内的SI已成为危害许多国家猪群的疾病。而且，猪是禽、猪、人流感病毒的易感宿主，可最大限度地彼人等其他动物流感病毒和禽流感病毒所感染，成为流感病毒基因重组或重配的“混合器”，是流感病毒新流行毒株产生的“孵育器”。因此，猪流感的控制不仅有经济上的意义，更有其深远的公共卫生学意义。目前，广泛应用于临床的是单价或多价的猪流感病毒灭活疫苗。但猪流感病毒在鸡胚中连续传代有可能影响病毒的免疫原性。而且其免疫剂量大，同时还必须使用佐剂，从而增加了灭活疫苗的成本。因此，研制新一代疫苗以替代或作为灭活疫苗的有益补充就显得尤其必要。另外，猪流感疫苗的研究应该尽可能兼顾目前主要流行的几种亚型。DNA疫苗因为能够同时诱导体液免疫应答和细胞免疫应答而受到青睐。基于猪流感病毒血凝素HA的DNA疫苗的研究已经取得了一定的效果。但由于DNA疫苗蛋白表达量低，激发的免疫应答较弱，从而限制了它的应用。因此，提高DNA疫苗的免疫效果已成为基因免疫研究的热点。一系列的研究表明，多拷贝的C3d分子与靶抗原偶联极大地提高了特异抗原的免疫应答水平。另外，用DNA疫苗免疫后再用重组病毒加强免疫的prime-boost免疫策略也显示了很好的免疫效果。本研究探讨了上述两种策略在猪流感疫苗上的应用效果。 为了探讨分子佐剂C3d对猪流感病毒HA-DNA疫苗免疫原性的影响，本研究构建了四种表达不同形式HA的质粒DNA，分别为：表达分泌型HA的质粒pCA-sHA，表达全长HA的质粒pCA-tmHA和融合表达三拷贝C3d(鼠源和猪源)与HA的质粒pCA-sHA/mC3d3和pCA-sHA/sC3d3。四种质粒与空载体pCAGGS分别免疫BALB/c小鼠后，分别用ELISA、HI试验和中和试验检测抗HA抗体水平，并用硫氰酸盐洗脱法检测抗体亲和力水平。结果显示，免疫后第8周，pCA-sHA组与pCA-tmHA组的抗体水平没有明显差别，而pCA-sHA/mC3d3和pCA-sHA/sC3d3免疫组的抗体水平显著高于这两组，并具有更强的抗体亲和力。淋巴细胞增殖试验及细胞因子检测实验结果显示，免疫后第8周，pCA-tmHA诱导了更强的淋巴细胞增殖反应和更高水平的IFN-γ，而pCA-sHA/mC3d3和pCA-sHA/sC3d3诱导了更高水平的IL-4，结果说明，HA表达形式的变化影响了免疫反应的类型，C3d与HA融合后通过诱导IL-4的产生而使免疫反应倾向于Th2型。在随后的同型或异型病毒攻击试验中，通过对攻击病毒的分离、攻击病毒在免疫小鼠体内的分布情况以及攻毒后的免疫小鼠的病理变化的检测，证实四种质粒DNA都在不同程度上加速了同型攻击病毒的清除，对免疫小鼠产生了一定的保护作用。而pCA-sHA/mC3d3和pCA-sHA/sC3d3免疫的小鼠对异型毒的攻击也产生了一定的保护作用。结果表明，三拷贝分子佐剂C3d与分泌型HA融合后显著提高了DNA疫苗诱导的抗体水平，加速了抗体亲和力成熟，并可以部分抵抗异型病毒的攻击。另外，结果也表明，猪源补体C3d可以用小鼠做模型来评价其分子佐剂的效力。 为了评价用DNA疫苗和重组病毒联合免疫的效果，随后进行了第二次免疫攻毒试验。1-4组与5-8组分别免疫质粒pCA-sHA、pCA-tmHA、pCA-sHA/mC3d3和pCA-sHA/sC3d3，初次免疫后，间隔4周，1-4组再用同一种质粒加强免疫一次，5-8组用表达H3N2亚型猪流感病毒HA的重组伪狂犬病毒rPRV-HA加强免疫一次；第9组初次免疫用pCAGGS空载体，4周后用rPRV-HA加强免疫：第10组免疫PRVBartha-K61疫苗株；第11组为不免疫不攻毒组对照。血清学分析结果显示，对于rPRV-HA加强免疫组，在有DNA疫苗作基础免疫的组，抗体水平高于rPRV-HA单独免疫组。用DNA疫苗加强免疫与用rPRV-HA加强免疫诱导的抗体水平没有明显差别。但质粒pCA-sHA/mC3d3和pCA-sHA/sC3d3做基础免疫组的抗体水平要显著高于质粒pCA-sHA、pCA-tmHA做基础免疫的组。这表明，与C3d共表达的融合形式HA不但增强了抗体应答，而且引发了良好的抗体免疫记忆，因此，在用rPRV-HA加强免疫后，抗体水平迅速上升，在加强免疫后第4周抗体水平显著高于其他组。细胞因子检测实验结果显示，DNA疫苗与rPRV-HA联合免疫组的IL-4和IFN-γ的水平显著高于rPRV-HA单独免疫组。并且，用rPRV-HA加强免疫诱导的IL-4和IFN-γ的水平高于用同种DNA疫苗加强免疫诱导的细胞因子水平。结果表明，用rPRV-HA加强免疫普遍增强了免疫应答。在随后的同型猪流感病毒的攻击试验中，各免疫组都在不同程度上加速了同型攻击病毒的清除，对免疫小鼠产生了一定的保护作用。其中，用质粒DNA免疫后再用rPRV-HA加强免疫产生了最好的保护作用。 本研究构建的融合表达3拷贝C3d与HA的质粒DNA可能作为猪流感的候选疫苗，为预防多种亚型猪流感疫苗的研究探索了新的思路。另外，用质粒DNA做基础免疫再用rPRV-HA加强免疫的免疫策略，也为猪流感疫苗的研究提供了新的模式。

目录

文摘

英文文摘

声明

1引言

1.1猪流感的发生与流行概况

1.2猪流感病毒的种间传播及其公共卫生学意义

1.3猪流感病毒概况

1.4流感病毒HA的作用

1.4.1HA与病毒的致病力

1.4.2HA在基因工程疫苗研究中的作用

1.4.3基于流感病毒HA的基因工程疫苗的研究进展

1.5猪流感疫苗的研究进展

1.5.1全病毒灭活疫苗

1.5.2亚单位疫苗

1.5.3病毒活载体疫苗

1.5.4DNA疫苗

1.5.5猪流感疫苗小结

1.6增强DNA疫苗免疫效果的研究策略

1.6.1DNA疫苗的发现及其特点

1.6.2DNA疫苗可能的作用机制

1.6.3优化DNA疫苗的接种方法和途径

1.6.4CpG-ODN佐剂

1.6.5合理使用细胞因子佐剂

1.6.6抗原靶向APC的分子佐剂

1.6.7泛素佐剂

1.6.8VP22在DNA疫苗中的应用

1.7分子佐剂C3d的研究进展

1.7.1C3d的分子结构

1.7.2C3d的受体CR2

1.7.3C3d分子对免疫应答的增强作用

1.7.4C3d分子对免疫应答的抑制作用

1.7.5C3d分子佐剂可能的作用机制

1.7.6C3d分子小结

1.8Prime-boost免疫策略研究进展

1.9本研究的目的和意义

2材料和方法

2.1毒株、细胞和阳性血清

2.2质粒和受体菌

2.3主要试剂

2.4主要仪器设备

2.5主要溶液的配制

2.6RT-PCR扩增小鼠和猪补体C3d基因

2.7融合表达HA与C3d3真核表达载体的构建

2.8质粒DNA的人量制备与纯化

2.9Western blot检测重组蛋白在293T细胞中的表达

2.10BALB/c小鼠的免疫和攻毒试验

2.11终点稀释ELISA检测抗HA的抗体水平

2.12硫氰酸盐洗脱法检测抗体亲和力

2.13血凝抑制试验和微量中和试验

2.14淋巴细胞增殖试验

2.15细胞因子的检测

2.16攻毒后小鼠肺脏中病毒的分离

2.17攻毒后小鼠主要脏器的病毒粒子检测及病理学观察

2.18间接免疫荧光试验检测病毒在组织中的分布

2.19统计学分析

3结果

3.1小鼠和猪补体C3d基因的扩增

3.2表达不同形式HA的重组质粒的构建与鉴定

3.3Western blot检测HA的体外表达

3.4质粒DNA三次免疫对小鼠的免疫效力评价

3.4.1终点稀释ELISA检测免疫小鼠的血清抗体

3.4.2抗体亲和力的检测

3.4.3血凝抑制试验和中和试验结果

3.4.4淋巴细胞增殖试验结果

3.4.5细胞因子IL-4和IFN-γ检测结果

3.4.6攻毒后不同时间病毒分离结果

3.4.7IFA检测病毒在脏器中的分布

3.4.8主要脏器的病理学观察

3.5质粒DNA初免rPRV-HA加强免疫对小鼠的免疫效力评价

3.5.1终点稀释ELISA检测免疫小鼠的血清抗体

3.5.2血凝抑制试验和中和试验检测抗体

3.5.3细胞因子IL-4和IFN-γ检测结果

3.5.4攻毒后不同时间病毒分离结果

3.5.5IFA检测病毒在脏器中的分布

3.5.6主要脏器的病理学观察

4讨论

4.1猪流感基因工程疫苗的研究

4.2流感病毒HA的表达型对免疫应答的影响

4.3流感病毒异源免疫(HSI)的研究

4.4C3d作为分子佐剂的作用机制

4.5小鼠动物模型评价猪源C3d(sC3d)的免疫增强作用

4.6Prime-boost免疫策略的应用

4.7评价流感疫苗的小鼠动物模型

5结论

致谢

参考文献

附录

攻读博士学位期间发表的学术论文