激活前/后热激对猪孤雌胚胎早期发育的影响

摘要

哺乳动物的卵母细胞和早期胚胎对环境条件的改变较为敏感，而相对于其他物种来说猪卵母细胞和早期胚胎对温度更为敏感。为探讨高温对猪卵母细胞和早期胚胎发育的影响和机理，本次实验对体外成熟卵母细胞分别在孤雌激活前或孤雌激活后进行42℃持续2小时或4小时的热激，以孤雌胚胎的卵裂率、发育到囊胚的比例、诱导型热激蛋白70(HSP70)的表达与分布以及第二次减数分裂纺锤体微管的形态和分布为指标综合地研究了热激对猪孤雌胚胎植入前发育的影响。实验结果如下： 1)孤雌激活前2小时热激组的卵裂率(93.14±2.30％)显著(p＜0.05)高于4小时热激组(81.43±5.43％)，囊胚率(41.36±2.27％)显著(P＜-0.05)高于对照组(30.87±3.38％)和4小时热激组(30.37±3.52％)。三组囊胚平均细胞数差异不显著(35.87±3.99vs.40.25±3.05vs.37.84±3.03)。孤雌激活后热激组卵裂率、囊胚率与对照组相比均无显著差异，4小时热激组的囊胚平均细胞数(26.68±3.40)显著(P＜0.05)少于对照组(37.51±2.33)。 2)激活前热激，对照组和热激组HSP70表达水平无显著差异：激活后热激，2小时热激组HSP70表达水平显著低于4小时热激组，对照组和4小时热激组HSP70表达水平无显著差异。 3)激活前热激实验中，对照组和热激组卵母细胞内HSP70呈点状均匀分布，与染色体区无相关性；激活后热激，对照组和热激组染色体区均出现HSP70聚集现象，且随着热激时间的加长，聚集现象更为明显。 4)激活前热激导致微管紊乱和部分解聚；激活后热激也导致微管紊乱和部分解聚，纺锤体微管长轴与两组染色体的连线偏离，染色体分布分散。 研究表明：猪成熟卵母细胞在激活前和激活后对热激的反应性不同，胞质内HSP70的分布模式也不同。热激导致HSP70表达量的改变与孤雌胚胎植入前的发育能力无直接联系。热激造成猪卵母细胞/孤雌胚胎纺锤体微管的紊乱和解聚，但这种不利作用不影响猪孤雌胚胎的植入前发育。猪孤雌胚胎对热激表现出一定的抗性。

目录

文摘

英文文摘

声明

1引言

1.1热激蛋白的简介

1.1.1热激蛋白的发现和相关概念

1.1.2热激蛋白的分类

1.1.3热激蛋白的主要生物学特性

1.2热激蛋白与胚胎发育

1.2.1热激蛋白与胚胎正常发育

1.2.2应激状态下热激蛋白与胚胎发育

1.3热激对猪卵母细胞和早期胚胎发育的影响和HSP70的表达变化

1.3.1猪卵母细胞生长和成熟过程中HSP70的表达和对热激的反应

1.3.2胚胎基因组激活前热激对猪孤雌激活(PA)胚胎/体外受精(IVF)胚胎早期发育的影响

1.3.3胚胎基因组激活后热激对猪PA胚胎/IVF胚胎早期发育的影响

1.4本实验的研究内容、目的和意义

2材料和方法

2.1主要仪器和设备

2.2主要试剂及液体配制

2.3卵母细胞-卵丘复合体(COCs)的获取

2.4COCS的体外成熟培养

2.5卵丘细胞的去除和成熟卵母细胞的分选

2.6卵母细胞激活前的热激处理

2.7卵母细胞的孤雌激活

2.8卵母细胞激活后的热激处理

2.9孤雌激活胚胎的培养

2.10卵裂率、死亡率的观察

2.11囊胚染色和囊胚细胞数的观察

2.12Westernblot检测热激后猪卵母细胞/孤雌胚胎内HSP70含量的变化

2.12.1样品准备

2.12.2Westernblot实验流程

2.13激光共聚焦显微镜观察猪卵母细胞/孤雌胚胎内HSP70/微管蛋白的分布情况

2.14实验数据统计分析

3实验结果

3.1孤雌激活前热激对猪孤雌胚胎早期发育的影响

3.2孤雌激活后热激对猪孤雌胚胎早期发育的影响

3.3孤雌激活前热激对猪体外成熟卵母细胞HSP70含量的影响

3.4孤雌激活后热激对猪孤雌胚胎HSP70含量的影响

3.5孤雌激活前热激对猪卵母细胞内HSP70分布的影响

3.6孤雌激活前热激对猪卵母细胞内微管分布和形态的影响

3.7孤雌激活后热激对猪孤雌胚胎内HSP70分布的影响

3.8孤雌激活后热激对猪孤雌胚胎内微管分布和形态的影响

4讨论

4.1激活前热激对猪孤雌胚胎早期发育的影响

4.2激活后热激对猪孤雌胚胎早期发育的影响

4.3激活前／后热激对猪卵母细胞/孤雌胚胎内HSP70分布的影响

4.4激活前后热激对猪卵母细胞/孤雌胚胎内纺锤体微管的影响

5结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文