志贺样毒素Ⅱ型变异体B亚基单克隆抗体的制备

摘要

本研究应用PCR技术扩增了SLT-IIeB基因，经序列测定。结果与参考序列的同源性达100％。将PCR产物克隆到原核表达载体pET-30a中，转化入大肠杆菌BL21(DE3)并用IPTG诱导表达。通过Ni离子亲和层析纯化融合表达的SLT-IIeB蛋白，以此作为免疫原免疫BALB/c小鼠。利用细胞融合技术将小鼠脾细胞和SP2/0细胞融合，经间接ELISA检测和四次亚克隆，获得6株阳性杂交瘤细胞，分别命名为2810、3A8、3C11、3D7、3G7和4F3。经单克隆抗体亚类试剂盒鉴定，6株单克隆抗体的亚类包括IgG2a、IgG2b、IgA和IgM，且均为κ轻链。经杂交瘤细胞染色体数目分析，6株杂交瘤细胞的平均染色体数是90～115.明显多于SP2/0骨髓瘤细胞数(55～65)。ELISA检测结果显示，6株杂交瘤细胞培养上清液的效价分别为1:128～1:512。以两株分泌IgG类单克隆抗体的杂交瘤细胞(3G7.4F3)制备的腹水，效价均为1:105。阻断ELISA结果显示，6株单克隆抗体均与天然毒素(SLT-IIe)有良好的反应性，且不与天然毒素LT、ST反应。通过相加ELISA测定可知，3G7和4F3两株单克隆抗体是针对不同抗原表位的单抗。

目录

文摘

英文文摘

声明

1引言

1.1仔猪水肿病的概述

1.2仔猪水肿病的主要致病因子

1.2.1志贺样毒素Ⅱ型变异体(SLT-Ⅱe)

1.2.2定居因子F18ab(F107)菌毛

1.2.3致病机理

1.3仔猪水肿病的诊断

1.3.1流行病学特点

1.3.2临床症状和剖检病变

1.3.3实验室诊断

1.3.4应用单克隆抗体的检测方法研究进展

1.4仔猪水肿病的预防

1.5研究的目的与意义

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1质粒、菌株、实验动物和细胞系

2.1.2主要试剂

2.1.3主要仪器

2.1.4 PCR扩增引物

2.2实验方法

2.2.1 SLT-Ⅱ e B基因的克隆、表达及纯化

2.2.2单克隆抗体的制备

2.2.3杂交瘤细胞的鉴定

2.2.4单克隆抗体的鉴定

3结果

3.1 SLT-Ⅱe B基因的克隆、表达及纯化

3.1.1重组SLT-Ⅱe B基因克隆载体的鉴定

3.1.2重组SLT-Ⅱe B基因表达载体的鉴定

3.1.3重组质粒的表达及纯化

3.1.4 Western blot鉴定

3.2细胞融合与筛选

3.2.1 EIASA筛选方法建立

3.2.2细胞融合率

3.2.3阳性杂交瘤细胞的筛选

3.3杂交瘤细胞鉴定

3.3.1染色体数目分析

3.3.2杂交瘤分秘抗体稳定性鉴定

3.4单克隆抗体鉴定

3.4.1单克隆抗体亚类鉴定

3.4.2杂交瘤细胞培养上清液效价测定

3.4.3腹水单抗效价测定

3.4.4抗原表位分析

3.4.5单克隆抗体免疫活性鉴定

3.4.6单克隆抗体特异性鉴定

4讨论

5结论

致谢

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文