快速检测猪繁殖与呼吸综合征病毒免疫胶体金诊断试纸条的研制

摘要

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV)属于动脉炎病毒科(Arteriviridae),动脉炎病毒属(Arterivirus)，可引起怀孕母猪流产、早产及断奶仔猪肺炎、生长迟缓等症状，给养猪业带来严重经济损失。因此，建立能够对PRRSV进行现地快速检测的、简便的诊断方法是十分必要的。 本试验采用差速离心和蔗糖密度梯度离心法纯化病毒抗原，按常规方法免疫BALB/c小鼠，利用杂交瘤细胞技术融合小鼠脾细胞与SP2/0细胞，融合率为91.4％。用建立间接ELISA方法检测杂交瘤细胞上清，结果阳性率为20.6％。采用有限稀释法进行3次克隆，获得了5株抗PRRSV单克隆抗体(McAb)，分别命名为D5、D7、D10、E9和B5。5株McAb腹水的效价分别为1:25600、1:12800、1:6400、1:12800和1:6400。免疫球蛋白亚类鉴定结果显示，D5和B5属于IgG2b亚类，D7、D10和E9属于IgM亚类，而其轻链均为κ链。用原核表达的PRRSVN蛋白对家兔进行多次免疫，制备了兔抗PRRSVN蛋白抗体。 免疫胶体金诊断试纸条具有快速、简便等优点，结合单克隆抗体技术又有良好的特异性和敏感性，是目前现地应用最广泛的一种诊断方法。本试验利用柠檬酸三钠还原法制备粒径约为20nm的胶体金，选择抗体效价高，反应活性好且亚类为IgG2b的D5McAb与20nm的胶体金颗粒结合制备探针，同时将纯化的兔抗PRRsVN蛋白抗体和羊抗鼠lgG包被硝酸纤维素膜(NCM)分别作为检测线(T线)和质控线(C线)，组装成检测PRRSV的免疫胶体金诊断试纸条。敏感性试验结果表明，本试验组装的免疫胶体金诊断试纸条可以检出6.25μg/mL纯化的PRRSV抗原。在特异性试验中，用所组装的试纸条对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪细小病毒(PPV)进行检测，结果显示，该试纸条只能够检测出PRRSV为阳性，其余均为阴性。在现地试验中，对30份样本进行检测，结果显示，本试验组装的免疫胶体金诊断试纸条检出19份阳性病料，而RT-PCR方法检出21份阳性病料，总符合率为90.0％：阳性符合率为90.5％：阴性符合率为88.9％。

目录

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声明

1 引言

1.1猪繁殖与呼吸综合征病毒病原学

1.1.1分类地位

1.1.2形态特征

1.1.3理化特性

1.1.4培养特性

1.1.5分子生物学特性

1.1.6遗传变异

1.1.7致病机理

1.2PRRSV的检测方法

1.2.1病毒的分离与鉴定

1.2.2免疫组织化学法

1.2.3聚合酶链反应(PCR)技术

1.2.4核酸探针原位杂交技术(ISH)

1.3免疫胶体金快速诊断技术的应用

1.3.1免疫胶体金诊断试纸条基本原理

1.3.2免疫胶体金诊断试纸条的优点

1.3.3免疫胶体金诊断试纸条在猪病诊断上的应用

1.4课题研究的背景与意义

1.5研究内容及技术路线

1.5.1研究内容

1.5.2技术路线

2 材料与方法

2.1材料

2.1.1病毒与细胞

2.1.2实验动物

2.1.3主要试剂

2.1.4主要仪器及耗材

2.2方法

2.2.1抗PRRSV McAb的制备

2.2.2兔抗PRRSV N蛋白抗体的制备

2.2.3免疫胶体金诊断试纸条的组装

2.2.4免疫胶体金诊断试纸条反应条件的优化

2.2.5免疫胶体金诊断试纸条的性能测试

3 结果与分析

3.1抗PRRSV McAb制备结果

3.1.1PRRSV抗原的制备

3.1.2间接ELISA检测方法最佳工作条件的建立

3.1.3小鼠抗体水平检测

3.1.4细胞融合与筛选

3.1.5腹水的制备与纯化

3.1.6McAb的特性鉴定

3.2兔抗PRRSV N蛋白抗体制备结果

3.3免疫胶体金诊断试纸条的组装结果

3.3.1胶体金颗粒的质量

3.3.2McAb最适标记量的测定

3.3.3抗体标记反应时间的确定

3.3.4金标McAb稳定剂的选择

3.3.5金标McAb包被量的确定

3.3.6NCM抗体包被量的确定

3.3.7结合垫封闭液的选择

3.3.8样品垫封闭液的选择

3.3.9NCM封闭液的选择及浓度确定

3.4免疫胶体金诊断试纸条性能测试结果

3.4.1特异性试验

3.4.2敏感性试验

3.4.3保存期试验

3.4.4现地样本的检测

4 讨论

4.1关于抗PRRSV McAb的制备

4.1.1抗原的制备与动物免疫

4.1.2细胞融合

4.1.3杂交瘤细胞株筛选

4.1.4McAb的特性鉴定

4.2关于免疫胶体金诊断试纸条的组装

4.2.1胶体金的制备

4.2.2胶体金标记抗体最适pH值

4.2.3McAb与胶体金的结合比例

4.2.4NCM的封闭

4.3关于免疫胶体金诊断试纸条的特点及改进方向

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的论文