野生大豆非生物胁迫相关水通道蛋白基因克隆及功能分析

摘要

低温、高盐、干旱等非生物胁迫是制约我国乃至世界农业生产的重大问题,提高作物的耐胁迫能力,对于充分利用耕地资源、提高粮食产量、解决粮食安全问题具有重大的战略意义。近年来分子生物学与植物基因工程技术迅速发展并日趋成熟,通过分子育种提高作物的非生物胁迫耐性具有可观的前景。然而,植物耐非生物胁迫反应的分子机制复杂,可用于作物耐胁迫基因工程的基因资源比较缺乏。获得充足的、具有独立知识产权的基因资源,是进行作物分子育种的重要前提。水通道蛋白在多种非生物胁迫下表达水平均有变化,而目前关于水通道蛋白与非生物胁迫耐性关系的研究还比较少。克隆具有独立知识产权的水通道蛋白基因,并分析其与非生物胁迫耐性的关系,既可为水通道蛋白功能的研究及非生物胁迫反应机理的研究提供理论基础,又可为植物耐胁迫基因工程提供基因资源。
　　本研究以具有丰富耐逆基因资源的耐盐东北野生大豆为试材,利用商品化的大豆基因表达分析芯片,获得野生大豆盐胁迫EST数据库中各基因在非生物胁迫早期的表达情况,据此对野生大豆盐胁迫EST库进行了筛选,获得了2个在低温、高盐、干旱胁迫早期表达量均上调的水通道蛋白类EST;通过文库筛选、电子克隆和改进的RACE方法获得了野生大豆中相应基因的完整编码区;通过生物信息学方法预测了各基因产物的性质、结构和功能,2个基因分别编码质膜嵌入蛋白和液泡膜嵌入蛋白。通过对基因表达特性和细胞内定位的分析,以及对转基因植物非生物胁迫耐性的分析,确定了基因与植物非生物胁迫耐性的关系。研究结果可为植物非生物胁迫反应的分子机理研究以及耐胁迫基因工程研究提供重要的理论基础和基因资源。
　　主要研究结果如下:1.野生大豆非生物胁迫早期应答EST的筛选分别用低温、高盐、干旱3种非生物胁迫处理野生大豆幼苗,将3种胁迫后的的样品及正常条件下培养的对照样品分别与Affymetrix大豆基因表达分析芯片杂交,将野生大豆EST数据库中的2003个ESTs与芯片所包含的六万多个探针组序列进行BlastN比对,利用芯片探针组的信号变化注释了相应ESTs的表达情况。通过实时荧光定量PCR对芯片杂交结果进行了验证,二者所得结果的一致性约为78％,表明此跨物种的芯片杂交结果能够反映基因表达情况。根据芯片杂交结果推断了野生大豆盐胁迫EST库中各基因在各胁迫早期的表达情况,筛选出了在非生物胁迫早期(1h以内)表达量开始上调的非冗余EST241个。
　　2.野生大豆非生物胁迫早期应答水通道蛋白基因的克隆及序列分析利用多个蛋白质对非生物胁迫早期应答EST进行了注释,从中发现了10个代表膜相关蛋白的EST,其中有5个EST代表的基因属于水通道蛋白(aquaporin, AQP)或称主嵌入蛋白(major intrinsic protein, MIP)基因家族。其中,1个EST代表的基因属于TIP亚类(液泡膜结合蛋白, tonoplast intrinsic protein, TIP),另外4个EST代表的基因属于PIP亚类(原生质膜结合蛋白, plasma membrane intrinsic protein, PIP)。利用SMART技术对传统的RACE技术进行了改进(该方法已申请专利),结合PCR、文库筛选及电子克隆,获得了TIP类、PIP类的全长基因各1个,分别命名为GsTIP和GsPIP2,其产物氨基酸序列与苜蓿TIP、含羞草PIP的相似性分别为84％和90％,为2个全新的水通道蛋白基因。利用Clustal X、DNAman、Antheprot等分析软件,以及常用的数据库和在线分析工具,对所克隆的2个基因的编码产物GsTIP、GsPIP2的序列进行了物理性质、保守结构域、二级结构、细胞内定位等特征的分析,结果显示GsTIP、GsPIP2均具有水通道蛋白家族特征性的6段跨膜结构域、NPA保守序列以及高度疏水的物理性质,氨基酸序列与其它豆科植物的同类蛋白质有较高的相似性,表明GsTIP和GsPIP2分别为结合于液泡膜和原生质膜的水通道蛋白,其中GsPIP2属于PIP2类,GsTIP有可能属于TIP2类。在2个基因的序列中都存在潜在的磷酸化和肉豆蔻酰基化位点,表明它们可能受翻译后修饰的调控。
　　3.野生大豆水通道蛋白基因的细胞内定位分析构建了2个基因的植物瞬时表达载体,使基因产物C端与GFP融合,并通过农杆菌浸润法使其在烟草叶片表皮细胞中瞬时表达,通过激光共聚焦显微镜在蓝光下观察GFP的绿色荧光信号,分析基因产物在细胞中的定位。结果显示GsTIP定位于液泡膜,GsPIP2定位于原生质膜,与基因产物序列分析的结果一致。GsPIP2有较大程度的聚集现象,表明该蛋白有可能以聚合体形式定位在膜上。GsTIP也有一定程度的聚集。
　　4.野生大豆水通道蛋白基因的表达特性分析芯片杂交结果显示本研究所克隆的2个基因在野生大豆叶中受到高盐、低温、干旱3种非生物胁迫的早期均上调表达,利用半定量RT-PCR技术详细分析了2个基因在经低温、高盐、干旱3种胁迫处理0h,0.5h,1h,3h,6h后的野生大豆中根、叶中的表达水平变化。结果验证了芯片杂交结果,即在野生大豆叶中,GsTIP、GsPIP2的表达水平在高盐、低温、干旱3种胁迫下均升高。基因在根中的表达变化趋势与叶中相反,GsTIP的表达受到高盐和干旱胁迫的抑制,在低温胁迫下基本不变,GsPIP2的表达受3种胁迫的抑制。无论在叶中或根中,2个基因的表达水平对高盐胁迫与干旱胁迫的响应情况均有相似之处,而与基因对低温的响应不同。2个基因的表达特性之间也存在若干相似之处:在叶中均受3种胁迫的诱导,在根中均受高盐、干旱胁迫的抑制,在低温胁迫的叶中表达水平均在0.5h时迅速提高。
　　5.野生大豆水通道蛋白的非生物胁迫耐性分析分别构建了2个基因的植物超量表达载体,用组成型启动子CaMV35S使基因在植株中超量表达,利用花序浸蘸法用农杆菌对拟南芥花序进行遗传转化,通过抗生素筛选、PCR检测、定性及半定量RT-PCR检测,确定了超量表达目的基因的转基因株系。对超量表达目的基因的T2代转基因植株进行低温、高盐、干旱胁迫处理,对比了超量表达目的基因的拟南芥与野生型拟南芥种子在不同非生物胁迫下的萌发和生长状态,幼苗的成活率,成活幼苗的根长和鲜重,幼苗的失水/复水速率,幼苗在胁迫前后的水势,以及植株莲座叶在胁迫前后的蒸腾速率,以分析目的基因的超量表达对拟南芥非生物胁迫耐性的影响。
　　结果表明超量表达GsTIP、GsPIP2基因的植株对高盐和干旱胁迫的耐性均低于野生型植株,其中超量表达GsTIP的植株失水速率及蒸腾速率显著高于野生型植株,超量表达GsPIP2的幼苗地上部分水势在胁迫条件下显著低于野生型植株,推断GsTIP通过加强蒸腾作用而影响植物的胁迫耐性,而GsPIP2则通过影响细胞水势的调节而影响植物的胁迫耐性。

目录

摘要

Abstract

1 引言

1.1 研究目的和意义

1.2 文献综述

1.2.1 植物胁迫反应的分子机制

1.2.2 植物水通道蛋白与非生物胁迫的关系

1.3 本研究的总体技术路线及研究内容

1.3.1 本研究课题的来源

1.3.2 总体技术路线

1.3.3 研究内容

1.3.4 本研究的创新点

2 材料与方法

2.1 目的EST 的筛选

2.1.1 试验材料

2.1.2 试验方法

2.2 目的EST 的序列分析

2.2.1 试验材料

2.2.2 试验方法

2.3 非全长基因的电子克隆

2.3.1 试验材料

2.3.2 试验方法

2.4 通过5’-RACE 技术扩增目的基因未知片段

2.4.1 试验材料

2.4.2 试验方法

2.5 PCR 产物的T-A 克隆

2.5.1 试验材料

2.5.2 试验方法

2.6 基因全长序列的获得

2.6.1 试验材料

2.6.2 试验方法

2.7 基因产物的生物信息学分析

2.7.1 试验材料

2.7.2 试验方法

2.8 基因产物的细胞内定位分析

2.8.1 试验材料

2.8.2 试验方法

2.9 野生大豆中目的基因的表达特性分析

2.9.1 试验材料

2.9.2 试验方法

2.10 超量表达目的基因的拟南芥株系的获得

2.10.1 试验材料

2.10.2 试验方法

2.11 转基因拟南芥的非生物胁迫耐性分析

2.11.1 试验材料

2.11.2 试验方法

3 结果与分析

3.1 目的EST 的筛选

3.1.1 芯片杂交获得野生大豆ESTs 胁迫早期表达情况

3.1.2 芯片杂交结果的Real-time PCR 验证

3.1.3 野生大豆非生物胁迫早期应答膜蛋白类EST 的确定

3.2 目的EST 序列的分析

3.2.1 PTE-1929 的序列分析

3.2.2 PTE-1023 序列的分析

3.3 GsTIP 全长序列的获得

3.3.1 GsTIP 的全长验证PCR

3.3.2 GsTIP 全长验证结果分析

3.4 GsPIP 的电子克隆

3.4.1 PTE-1023 的电子延伸

3.4.2 电子延伸验证引物设计

3.4.3 电子延伸结果的PCR 验证

3.4.4 电子延伸验证结果分析

3.5 GsPIP 全长序列的获得

3.5.1 通过5’-RACE 获得未知部分序列

3.5.2 GsPIP 全长序列的获得

3.6 GsTIP 蛋白产物的生物信息学分析

3.6.1 GsTIP 与已知水通道蛋白的比较

3.6.2 GsTIP 的物理性质预测

3.6.3 GsTIP 的保守结构域预测

3.6.4 GsTIP 的二级结构预测

3.7 GsPIP 蛋白产物的生物信息学分析

3.7.1 GsPIP 与已知水通道蛋白的比较

3.7.2 GsPIP2 的物理性质预测

3.7.3 GsPIP2 的保守结构域预测

3.7.4 GsPIP2 的二级结构预测

3.8 GsTIP 与GsPIP2 蛋白的细胞内定位分析

3.8.1 GsTIP 瞬时表达载体的构建

3.8.2 GsTIP 的瞬时表达与细胞内定位分析

3.8.3 GsPIP2 瞬时表达载体的构建

3.8.4 GsPIP2 的瞬时表达与细胞内定位分析

3.9 野生大豆中GsTIP 与GsPIP2 的表达特性分析

3.9.1 野生大豆中GsTIP 的表达特性分析

3.9.2 野生大豆中GsPIP2 的表达特性分析

3.10 GsTIP 的非生物胁迫耐性分析

3.10.1 GsTIP 的超量表达载体构建

3.10.2 超量表达GsTIP 的拟南芥的获得

3.10.3 GsTIP 的非生物胁迫耐性分析

3.11 GsPIP2 的非生物胁迫耐性分析

3.11.1 GsPIP2 的超量表达载体构建

3.11.2 超量表达GsPIP2 的拟南芥的获得

3.11.3 GsPIP2 的非生物胁迫耐性分析

4 讨论

4.1 目的基因的选择

4.2 对5’-RACE 技术的改进

4.3 GsTIP 基因与非生物胁迫的关系

4.3.1 GsTIP 基因对非生物胁迫的响应

4.3.2 GsTIP 对非生物胁迫耐性的影响

4.4 GsPIP2 基因与非生物胁迫的关系

4.4.1 GsPIP2 基因对非生物胁迫的响应

4.4.2 GsPIP2 对非生物胁迫耐性的影响

4.5 GsTIP、GsPIP2 基因的应用前景

4.5.1 基因在非生物胁迫反应分子机理研究中的应用前景

4.5.2 基因在耐逆分子育种研究中的应用前景

5 结论

致谢

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文