捻转血矛线虫体外培养条件优化和H11蛋白提取及氨肽酶活性分析

摘要

捻转血矛线虫（Haemonchuscontortus）是牛羊等反刍动物的一种重要消化道寄生虫。目前，药物防治是控制该病的主要方法，但药物残留、环境污染、抗药性虫株的出现和蔓延，使得传统的治疗受到严重挑战，迫切需要一种有效的防治方法以控制其感染和流行。
　　 捻转血矛线虫H11蛋白是一种分子量在110ku的完整膜糖蛋白复合物，可引起与血清抗体有关的高水平的保护作用。天然H11免疫动物后，可使雄虫减少70％、雌虫减少80％、虫卵减少90％，且对不同年龄阶段的绵羊均具有保护作用，且其保护率与抗体水平也呈正相关。但是由于原核系统对表达产物的翻译后加工、修饰、糖基化等作用不能达到真核系统的要求，其重组形式仅能提供很小的免疫保护，免疫效果远不及天然抗原。
　　 目前获取H11所需的成虫是从自然感染羊的皱胃里采得，成本高且操作复杂，受季节性及羊自身感染程度等因素的限制，往往混杂其他线虫，具有纯度和数量的不确定性，不适合于长期研究，不能适应科研的大量需要。急切需要找到一种利用体外培养来大量获得虫体的方法。本研究探索了温度、pH值、培养基等因素在离体培养中的作用及相互关系，优化了捻转血矛线虫离体培养体系。对培养的L4期幼虫和自然感染的成虫的H11天然蛋白分别进行了提取和纯化，并进行了氨基肽酶活性分析。为利用体外培养获取捻转血矛线虫H11天然抗原和制备天然抗原疫苗的研究奠定基础。
　　 1.相同条件下，在一定的温度范围内，虫卵的孵化率及孵化速度与温度成正比，虫卵的最适发育温度为34℃，孵化率高达97％。
　　 2.相同条件下，NCTC135、NCTC109、和M199培养系中的L3可发育至L4晚期，F12中L4只发育至早四期，四种培养系中L3发育至L4的虫体数占存活虫体数的比例以NCTC135中的最高，达99％。
　　 3.pH5.8-6.2时，L3发育至L4速度慢，发育率不到50％；pH6-5.6.7时，L3发育至L4的程度及发育率明显提高，以pH6.7为最佳。
　　 4.成功提取并纯化了L4期幼虫及成虫体内的H11天然蛋白，经SDS-PAGE电泳分析证实了H11蛋白的分子量为110ku，H11蛋白在L4期幼虫及成虫体内均有表达，且主要存在于成虫体内。
　　 5.对L4幼虫及成虫H11蛋白的氨基肽酶活性分析表明，H11天然蛋白同时具有氨肽酶M活性和氨肽酶A活性。
　　 6.对H11酶抑制剂敏感性测定得出EDTA和邻二氮杂菲对其酶活性均有抑制作用。

目录

文摘

英文文摘

Contents

1 引言

1.1 捻转血矛线虫病概述

1.1.1 病原学

1.1.2 流行状况

1.1.3 症状和病理变化

1.1.4 诊断与防治

1.2 捻转血矛线虫抗原的研究进展

1.2.1 隐蔽抗原（Hidden antigen）

1.2.2 天然抗原（Natural antigen）

1.2.3 重组抗原（Recombiilant antigen）

1.3 捻转血矛线虫体外培养方法的研究进展

1.4 捻转血矛线虫疫苗的研究进展

1.5 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 实验所用虫种

2.1.2 实验动物

2.1.3 培养基

2.1.4 实验所用主要溶液

2.1.5 主要实验仪器与设备

2.2 方法

2.2.1 捻转血矛线虫虫卵采集与孵化

2.2.2 第三期幼虫的收集净化与脱鞘

2.2.3 第三期幼虫的接种和培养

2.2.4 捻转血矛线虫L4幼虫及成虫H11蛋白的提取与纯化

2.2.5 H11蛋白的浓缩与纯化

2.2.6 测定H11氨基肽酶酶活性

2.2.7 测定H11氨基肽酶酶抑制剂敏感性

3 结果

3.1 虫卵、各期幼虫及成虫形态特点

3.2 温度对捻转血矛线虫虫卵孵化为L3幼虫的影响

3.3 不同培养基对捻转血矛线虫从L3发育到L4期幼虫的影响

3.4 不同pH值对捻转血矛线虫L3的发育及对L4的影响

3.5 H11提取及纯化蛋白的SDS-PAGE分析

3.5.1 H11提取蛋白的SDS-PAGE分析

3.5.2 纯化的H11蛋白SDS-PAGE分析及浓度测定

3.6 H11蛋白氨基肽酶活性分析

3.6.1 氨肽酶M（ApM）活性分析

3.6.2 氨肽酶A（ApA）活性分析

3.7 H11蛋白酶抑制剂敏感性分析

3.7.1 EDTA浓度与酶活性的关系

3.7.2 邻二氮杂菲浓度与酶活性的关系

4 讨论

4.1 温度对捻转血矛线虫虫卵孵化为L3的影响

4.2 不同培养基对捻转血矛线虫从L3发育到L4的影响

4.3 不同pH值对捻转血矛线虫L3的发育及对L4的影响

4.4 捻转血矛线虫幼虫体内发育与体外发育情况的差异

4.5 捻转血矛线虫L3与L4在营养物质需求上的差异

4.6 L4及成虫H11蛋白的提取与纯化

4.7 L4及成虫H11蛋白的氨基肽酶活性及其对酶抑制剂敏感性的分析

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文