番茄长花柱品系T431温敏相关ESTs分析及LeMBF1在花芽分化中的功能初析

摘要

番茄（LycopersiconesculentumMill）属于茄科番茄属（Lycopersicon），为白花授粉作物。其营养丰富，果实中富含胡萝卜素、番茄红素、维生素C以及柠檬酸等有机酸和无机盐等。此外，由于番茄易于转化、果实大、种子多，在植物组织培养、基因工程等研究中都是重要的模式植物。
　　 番茄在生产上主要以杂交种为主，其杂种优势明显，杂种整齐度高、抗逆性强，但目前番茄的杂交制种都以人工去雄授粉的方式进行，因此番茄雄性不育系的选育显得尤为迫切和重要。T431为经多代自交选育的番茄长花柱功能型雄性不育品系，该材料在20℃以上的田间温度下可以达到95％以上的不育率，但在低温条件下（昼/夜为18℃/10℃）则花柱内缩或与花药平齐，由不育材料变为可育材料。本实验室先前已构建了T431的温敏正反向差减文库，本试验即对所得差减文库的ESTs进行了分析，并以转录辅激活因子MBF1（MultiproteinBridgingFactor1，多蛋白桥梁因子）为研究对象，克隆其全长并作了初步的表达分析，探讨它在T431花柱发育中的作用，为最终阐明T431长花柱温敏现象的调控机制提供参考。
　　 1.本实验通过菌液PCR和反向Northern对构建的番茄T431正反向差减文库的725个克隆进行筛选，结果发现有429个克隆存在差异表达，将差异表达基因测序分析后获得了374个可利用的ESTs序列，可利用率达到87.2％。
　　 2.登陆GenBank对所得序列进行比较分析，结果显示374个可利用的ESTs序列中有324个具有蛋白编码功能，其余50个ESTs与已知蛋白质同源性较低或找不到任何同源序列。在324个具有蛋白质功能的ESTs序列中有228个序列功能已知，96个与推测、假想或功能未知的蛋白质具有很高的同源性。
　　 3.通过BLASTx和BLASTn对所有ESTs序列进行功能分类后，发现参与初级代谢（16％）、能量代谢（9％）、抗病与防御（12％）、信号转导（11％）等过程的基因较多，也有少数基因参与了植物体内蛋白质合成与加工、物质运输、转录调控、细胞的结构与生长发育等过程。
　　 4.选取与转录调控有关的ESTs即真核翻译起始因子（eIF-5A）、果胶酯酶（Pme）、转录辅激活因子MBF1，用半定量RT-PCR进行表达分析，发现在常温和低温条件下eIF-5A，Pme基因在T431根、茎尖生长点、叶中的表达量基本一致，说明这两个基因和T431的花柱发育的低温胁迫无关。而MBF1基因在常温下于T431的根、茎尖生长点、叶中均有表达，但茎尖生长点中表达量极低；将花芽分化期的T431经低温处理3d，6d，9d后，MBF1在根中的表达量不变；在叶中表达量低温处理初期略有增加，随后降低；而在茎尖生长点低温处理3d后，其表达量明显增加，其后随低温处理时间延长，逐渐降低，说明MBF1可能参与了花器官的形态建成，抑制了T431的花柱伸长。
　　 5.获得了一个编码转录辅激活因子基因MB目的全长cDNA序列，命名为LeMBF1。该基因包含一个420bp的开放阅读框，编码140个氨基酸。经NCBI的BLASTx和DNAMAN软件对LeMB目的氨基酸与其他植物MBF1蛋白进行比较，发现其氨基酸序列与马铃薯的StMBF1相似性最高，达到97％。
　　 6.从T431基因组中克隆得到MB目的全长DNA序列，将LeMB目的DNA序列与mRNA序列进行比较发现两者完全一致，说明该基因不含有内含子。

目录

文摘

英文文摘

CONTENTS

1.前言

1.1 引言

1.2 差异表达基因克隆方法的研究进展

1.2.1 MRNA差异显示技术

1.2.2 CDNA代表性差异分析

1.2.3 抑制性消减杂交技术

1.2.4 CDNA微阵列杂交技术

1.2.5 基因表达系列分析技术

1.2.6 RNA指纹技术

1.3 转录因子的研究进展

1.3.1 转录因子的种类

1.3.2 转录因子的作用特点

1.3.3 转录因子的结构与功能研究

1.4 转录辅激活因子的研究进展

1.4.1 转录辅激活因子的作用机制

1.4.2 MBF1转录辅激活因子的研究进展

1.5 生物信息学的应用研究进展

1.5.1 生物信息学的概念与发展

1.5.2 生物信息学在基因克隆中的应用

1.6 研究的目的和意义

2.材料和方法

2.1 实验材料

2.1.1 供试材料

2.1.2 供试菌株

2.1.3 主要试剂

2.1.4 试剂盒

2.1.5 主要仪器

2.2 实验方法

2.2.1 抑制性差减CDNA文库的筛选及测序分析

2.2.2 长花柱突变体温敏候选基因的确定

2.2.3 温敏候选基因的表达分析

2.2.3 番茄LEMBF1基因MRNA序列的克隆及序列分析

2.2.4 番茄LEMBF1基因组DNA序列的克隆及序列分析

3.结果与分析

3.1 BLASTN、BLASTX比对及ESTS序列的分类

3.2 总RNA提取结果

3.2.1 琼脂糖凝胶电泳检测结果

3.2.2 总RNA浓度及纯度检测

3.3 温敏候选基因的表达分析

3.3.1 EIF-5A的表达分析

3.3.2 PME的表达分析

3.3.3 LEMB目的表达分析

3.4.LEMBF1基因MRNA序列的克隆

3.4.1 反转录CDNA及PCR扩增

3.4.2 PCR扩增产物的回收和纯化

3.4.3 转化重组菌的鉴定筛选

3.4.4 重组质粒的鉴定

3.4.5 LEMB目的MRNA序列分析

3.4.6 LEMB目的同源性和亲缘关系分析

3.5 LEMBF1基因组DNA序列的克隆

3.5.1 DNA的提取及完整性检测

3.5.2 LEMB目的PCR扩增

3.5.3 重组菌的筛选及重组质粒的鉴定

3.5.4 LEMB目的基因组DNA序列分析

4.讨论

4.1 抑制性消减杂交文库的筛选及其EST序列分析

4.1.1 物质代谢和能量代谢类基因

4.1.2 生物胁迫和非生物胁迫类基因

4.1.3 转录调控相关基因

4.1.4 信号转导类基因

4.1.5 次生代谢相关基因

4.1.6 其它基因

4.2 番茄T431温敏候选基因分析

4.2.1 EIF-5A基因的作用分析

4.2.2 PME基因的作用分析

4.2.3 LEMBF1基因的功能分析

4.3 今后研究方向

5.结论

致 谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文