鹅细小病毒抗体胶体金免疫层析检测试纸条的研制

摘要

小鹅瘟（Gosling plague，GP）是由细小病毒科、依赖病毒属中的鹅细小病毒（Goose Parvovims，GPV）引起的一种烈性传染病，主要侵害4日龄至20日龄内的雏鹅和雏番鸭，引起急性肠炎及肝、肾、心等实质脏器败血性病变，尤其以小肠部位的纤维性、栓塞性病变为主要特征，发病率和死亡率可高达90％以上。目前，此病每年都有不同程度的流行，是养鹅及番鸭地区最主要的传染病之一，造成了严重的经济损失。由于本病长期困扰着养鹅业的发展，所以需要一种准确、简便的快速诊断方法来对该病作出早期诊断。
　　 胶体金免疫层析（GICA）技术正是一种简易、快速的免疫学检测技术，自从20世g90年代初由Beggs等用于人绒毛膜促性腺激素（HCG）的测定以来，在很多领域都有应用，如激素或疾病有关蛋白的检测；病原微生物有关蛋白或抗原抗体的检测；寄生虫相关抗原、抗体的检测；血、尿药物浓度的监测。但目前仍没有应用此技术检测鹅细小病毒抗体的报道，而由于此技术的特性，将其应用于鹅细小病毒抗体的快速检测，将对养鹅业的健康发展产生重要影响。
　　 GPV-VP3蛋白是病毒的主要衣壳蛋白，约占衣壳蛋白总含量的80％，暴露于病毒粒子表面的氨基酸序列均出现在VP3蛋白多肽链内，且VP3内含有GPV主要抗原决定簇成分，是GPV主要免疫保护性抗原，能特异性结合自然感染鹅血清中的抗体，因此，其能够作为金标记抗原，捕获抗体。本研究用柠檬酸钠-氯金酸氧化还原法制备18nm胶体金颗粒，标记鹅细小病毒（GPV）VP3重组蛋白制作金标垫，检测线的捕获抗体为兔抗鹅IgY多克隆抗体，质控线的捕获抗体为兔抗VP3多克隆抗体，组装胶体金免疫层析试纸条，检测鹅细小病毒抗体，并利用Point-of-caretesting（POCT）scanner，进行定量研究，最低检出量为9.89ng/mL。制得的试纸条与琼脂扩散试验（AGP）、酶联免疫吸附试验（ELISA）相比，符合率分别为100％、97.7％。
　　 由于本研究的试纸条特异性强、敏感性高、简便快速、重复性好，所以其可用于快速诊断鹅细小病毒抗体，监测鹅体内的抗体水平及其变化规律，便于适时进行免疫防护，减小了该病对养鹅业的危害，有利于养鹅业健康、稳定的发展。

目录

文摘

英文文摘

Contents

1 引言

1.1 鹅细小病毒概述

1.1.1 GPV的形态结构和理化特性

1.1.2 GPV的宿主范围和培养特性

1.2 GPV的分子生物学研究进展

1.2.1 GPV的基因组结构

1.2.2 GPV的转录与复制

1.2.3 GPV病毒基因编码的蛋白

1.3 鹅细小病毒病

1.3.1 GPV流行病学

1.3.2 鹅细小病毒病的临床症状

1.3.3 鹅细小病毒病的病理变化

1.3.4 诊断与防治

1.4 免疫胶体金标记技术的研究进展

1.4.1 免疫金标记技术

1.4.2 免疫胶体金标记技术的应用

1.5 研究的目的与意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌种、蛋白与血清

2.1.2 实验动物

2.1.3 主要试剂

2.1.4 主要仪器

2.2 方法

2.2.1 GPV-VP3的诱导表达、包涵体的提取、纯化与透析

2.2.2 GPV-VP3蛋白浓度的测定

2.2.3 兔抗鹅IgY、兔抗GPV-VP3多克隆抗体的制备及纯化

2.2.4 免疫胶体金颗粒的制备

2.2.5 免疫胶体金试纸条的制备

2.2.6 免疫胶体金试纸条的组装和测试

3 结果

3.1 GPV-VP3的诱导表达、包涵体的提取、纯化与透析

3.1.1 GPV-VP3的诱导表达、包涵体的提取

3.1.2 GPV-VP3的纯化与透析

3.2 GPV-VP3蛋白浓度的测定

3.3 兔抗鹅IgY多克隆抗体的制备及纯化

3.3.1 纯化前后兔抗鹅IgY多抗效价的测定

3.3.2 纯化后兔抗鹅IgY多抗纯度的鉴定

3.3.3 纯化后兔抗鹅IgY多抗浓度的测定

3.4 兔抗GPV-VP3多克隆抗体的制备及纯化

3.4.1 纯化前后兔抗GPV-VP3多抗效价的测定

3.4.2 纯化后兔抗GPV-VP3多抗纯度的鉴定

3.4.3 纯化后兔抗鹅IgY多抗浓度的测定

3.5 胶体金质量鉴定

3.5.1 颜色观察

3.5.2 紫外扫描鉴定

3.5.3 透射电镜扫描鉴定

3.6 胶体金免疫层析试纸条的制备

3.6.1 金标蛋白最佳标记pH值、最适标记蛋白量的确定

3.6.2 胶体金标记蛋白的鉴定

3.6.3 试纸条的初步组装及检测结果的分析

3.6.4 试纸条反应条件的优化

4 讨论

4.1 胶体金免疫层析技术检测GPV抗体的应用前景

4.2 关于金颗粒的讨论

4.3 关于试纸条优化过程中假阳性结果问题

4.3.1 电荷的影响

4.3.2 关于离子强度的影响

4.3.3 关于表面活性剂、变性剂的影响

4.3.4 关于封闭液的影响

4.3.5 关于NC膜处理液的影响

4.4 关于试纸条的性能

4.5 对比试验结果

5 结论

致 谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文