三种夜蛾β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶和蜕皮激素接受子3基因的克隆与表达研究

摘要

昆虫蜕皮是一个复杂的生理过程，在这个过程中有多种酶、激素和受体分子参与其中，本研究对其中分解体壁和中肠围食膜几丁质的β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶以及一种蜕皮激素受体.蜕皮激素接受子3进行了初步研究。
　　 几丁质是由N-乙酰氨基葡萄糖胺以β-1，4糖苷键连接而成的高分子聚合物，在自然界中是仅次于纤维素的第二大可再生自然资源。广泛分布于无脊椎动物的外骨骼和角质层，同时在真菌和藻类的细胞壁中大量存在。β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶是昆虫几丁质代谢中一种关键酶，在昆虫的多种生理活动中发挥重要作用。
　　 本研究针对昆虫β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶基因时序性表达的特点，确定了在其活性较高的预蛹时期来提取mRNA，进一步通过RT-PCR、RACE等技术克隆了小地老虎的β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶cDNA并且分析了它的分子特性，同时构建原核表达载体，完成小地老虎β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因在大肠杆菌表达系统中的表达。
　　 小地老虎β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶cDNA序列含有2579个碱基，包括一个1788个碱基的开放阅读框，编码一个含595个氨基酸的多肽，分子量约为68.3 kDa，等电点为5.48。获得的小地老虎β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因cDNA序列已经登录GenBank并获得登录号GU985280。
　　 利用Expasy molecular biology server的Scanprosite facility对推导的小地老虎β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶氨基酸的结构域进行预测，结果发现其最显著的特点是含有两个高度保守区：一是在氨基酸序列的N-端含有一个Glycosyl hydrolases family20区，另一个是在C-端220个氨基酸附近有一个Glycosyl hydrolases family20 catalytic domain区。这两个保守区在GH20家族其他成员中均有发现。推导得到的小地老虎β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶氨基酸序列含有三个N-位糖基化位点和一个O-位糖基化位点。
　　 与其他昆虫β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶同源性比较结果显示：它们的cDNA序列和氨基酸高度同源。以上结果表明我们克隆的基因是一条新的β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因。
　　 将小地老虎β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因与表达载体pTYB11重组，经异丙基-β-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导，在菌体中检测到融合蛋白。
　　 蜕皮激素接受子3（hormone receptor3，HR3），是一种蜕皮调节转录因子，调控蜕皮过程中相关基因的表达，是蜕皮级联反应中的关键因子。本研究以八字地老虎和粘虫预蛹期幼虫为材料，分别提取总RNA，利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术（RACE），分别扩增得到两种昆虫蜕皮激素接受子3（HR3）的5’非编码区和完整开放读码框在内的cDNA序列，其中八字地老虎的HR3 cDNA序列含有1729个碱基，包括一个1533个碱基的开放阅读框，编码一个含510个氨基酸的蛋白，分子量约为57.5kDa。粘虫的HR3 cDNA序列含有1743个碱基，包括一个1536个碱基的开放阅读框，编码一个含511个氨基酸的蛋白，分子量约为57.9 kDa。
　　 八字地老虎和粘虫HR3 cDNA序列推导的氨基酸序列均具有昆虫核受体超家族特征性结构域，与其他昆虫，尤其是鳞翅目昆虫的蜕皮激素接受子3的氨基酸序列高度同源。获得的基因cDNA序列已经登录Genbank并获得登录号，八字地老虎HR3登录号为GU188853，粘虫HR3登录号为GU188854。

目录

文摘

英文文摘

英文目录

1 引言

1.1 几丁质简介

1.2 昆虫蜕皮

1.3 β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶和蜕皮激素接受子3

1.3.1 β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶

1.3.2 蜕皮激素接受子3（HR3）

1.4 应用与前景

1.4.1 β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶的应用前景

1.4.2 蜕皮激素接受子3的应用前景

1.5 国内外研究现状

1.5.1 昆虫β-N-乙酰葡萄糖胺糖苷酶cDNA的克隆

1.5.2 昆虫蜕皮激素接受子3基因cDNA的克隆

1.5.3 昆虫β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因在虫体内的表达

1.5.4 昆虫蜕皮激素接受子3基因的体内表达

1.5.5 昆虫β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶和蜕皮激素接受子3基因的拷贝数研究

1.5.6 NAG在临床的应用价值

1.5.7 NAG在水生动物方面的应用

1.5.8 丙酮、巯基乙醇等有机溶剂对黄粉虫NAG酶活力的影响

1.6 昆虫蜕皮在防治害虫领域的展望

1.7 三种鳞翅目昆虫介绍

1.8 本论文研究的目的和意义

1.8.1 研究目的

1.8.2 研究意义

1.9 本研究课题的来源及主要研究内容

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 菌株与质粒

2.1.2 分子生物学用酶及试剂盒和各种试剂

2.1.3 培养基

2.1.4 仪器设备

2.1.5 昆虫来源

2.2 研究方法

2.2.1 总RNA提取

2.2.2 利用RT-PCR扩增保守区之间的cDNA序列

2.2.3 RACE引物设计

2.2.4 3'-RACE的试验步骤

2.2.5 5'-RACE的试验步骤

2.2.6 全长cDNA的获取及其序列分析

2.3 cDNA序列分析

2.3.1 利用Blast软件进行序列相似性检索

2.3.2 分子质量、碱基组成、碱基分布

2.3.3 全长cDNA可读框架分析

2.3.4 对ORF进行限制性酶切分析

2.3.5 核酸序列对齐分析的功能预测

2.4 蛋白质基本性质分析

2.4.1 信号肽分析

2.5 蛋白质功能预测

2.5.1 蛋白质序列同源性分析及蛋白质功能预测

2.5.2 结构位点、结构功能域数据库的蛋白质功能预测

2.6 蛋白质结构预测

2.6.1 蛋白质二级结构预测

2.6.2 蛋白质三级结构预测

2.7 β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达研究

2.7.1 β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因cDNA序列ORF的PCR反应

2.7.2 PCR产物酶切反应

2.7.3 E.coli质粒DNA提取和酶切

2.7.4 大肠杆菌表达载体构建

2.7.5 β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因在大肠杆菌中诱导表达

2.7.6 SDS-PAGE电泳

2.7.7 三氯乙酸（TCA）沉淀

3 结果与分析

3.1 RNA的提取

3.1.1 RNA完整性的检测

3.1.2 纯度及产量检测

3.2 RT-PCR得到的基因特异性片段及序列分析

3.2.1 β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因特异性片段及序列分析

3.2.2 蜕皮激素接受子3（HR3）基因特异性片段及序列分析

3.3 cDNA序列的3'-RACE结果

3.3.1 β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因cDNA序列的3'-RACE结果

3.3.2 蜕皮激素接受子3基因cDNA序列ORF3'cDNA序列的克隆结果

3.4 cDNA序列的5'-RACE结果

3.4.1 β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因5'-RACE结果

3.4.2 β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因5'-RACE的测序结果

3.4.3 蜕皮激素接受子3（HR3）5'-RACE结果

3.5 基因cDNA序列的获得

3.5.1 β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因cDNA序列的获得

3.5.2 蜕皮激素接受子3基因cDNA序列的获得

3.6 β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶和蜕皮激素接受子3基因特征

3.6.1 碱基序列组成分析

3.6.2 氨基酸序列组成分析

3.6.3 信号肽分析

3.7 氨基酸结构域预测

3.7.1 β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶氨基酸结构域预测

3.7.2 蜕皮激素接受子3氨基酸结构域预测

3.8 氨基酸的疏水性分析

3.8.1 β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶氨基酸疏水性分析

3.8.2 蜕皮激素接受子3氨基酸疏水性分析

3.9 序列同源性比较

3.9.1 β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因与其它昆虫同源性比较

3.9.2 蜕皮激素接受子3基因与其它昆虫同源性比较

3.9.3 聚类分析

3.10 β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达

3.10.1 大肠杆菌重组表达载体的构建和鉴定

3.10.2 β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶基因在大肠杆菌中的融合表达

4 讨论

4.1 关于小地老虎β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶拷贝数的探讨

4.2 关于八字地老虎和粘虫蜕皮激素接受子3拷贝数的探讨

4.3 小地老虎β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶表达系统的选择

4.4 感受态细胞的制备和载体构建的探讨

4.5 三氯乙酸（TCA）沉淀蛋白的讨论

5 结论

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间发表的学术论文