发育潜能不同的猪2-细胞期孤雌胚胎差异表达基因的筛选

摘要

胚胎的初次卵裂时间是衡量胚胎质量和后续发育能力的重要指标之一，以初次卵裂时间为基础选择发育能力不同的胚胎做研究对象，再通过相应的试验技术可以使我们发现一些影响胚胎发育能力的母源基因。猪的胚胎基因组激活（Embryonicgenomeactivation，ZGA）在4-细胞期，如果之前的发育均由源自卵子的母源mRNAs调控，则早卵裂的胚胎与晚卵裂胚胎间各种mRNA丰度的不同将极可能表现在2-细胞期。鉴定出该时期表达丰度不同的mRNAs，可以使我们获得与胚胎发育能力有重要关系的母源基因，同时也有助于我们发掘胚胎早期发育过程中初次卵裂时间影响胚胎后续发育能力的原因。
　　 本试验以猪孤雌胚胎为材料，根据初次卵裂时间的早晚划分出发育能力不同的两组胚胎，比较其mRNAs丰度。利用mRNA差异显示技术（mRNADifferentialDisplayReverseTranscriptionPCR，DDRT-PCR）筛选出两组胚胎中表达丰度不同的mRNAs。采用反Northorn-blot技术进行阳性片段的鉴定。利用PCR和5'RACE（Rapid-Amplification of cDNA Ends）技术对阳性片段E3所在的CPEB2基因进行全长cDNA克隆。利用SYBRGreen荧光定量PCR技术得到了该基因在早期胚胎中的表达模式。
　　 1.经反Northern-blot验证，发现有8条差异表达的阳性cDNA片段（E1-E4；L1-L4），其中四条（E1-4）在早卵裂（发育潜能较高）胚胎中表达量较高；四条（L1-L4）在晚卵裂（发育潜能较低）胚胎中表达量较高。
　　 2.8条阳性片段克隆、测序后与GenBank中猪的基因数据库进行同源性比对分析，其中6条（E1，E2，E3，L1，L2，L4）与已知猪的ESTs有较高的同源性。
　　 3.经过与GenBank中人的基因数据库对比，发现在卵裂较快的胚胎中表达量较高的E3与人CPEB2的同源性为97％；在卵裂较慢的胚胎中表达量较高的L3与人hnRNPA1的同源性89％。
　　 4.首次成功克隆了猪CPEB2cDNA，提交到NCBI，获得基因登录号：HM037344。
　　 5.首次确定猪胚胎中存在CPEB2基因，经荧光定量PCR进一步证明E3的表达量在早卵裂和晚卵裂胚胎中明显不同，表达模式与其他功能性转录子一致。

目录

文摘

英文文摘

英文目录

1 前言

1.1 研究背景与科学意义

1.2 文献综述

1.2.1 胚胎早期发育的相关研究

1.2.2 孤雌生殖

1.2.3 有关胚胎初次卵裂时间的研究

1.2.4 mRNA差异显示技术

1.3 研究的目标与内容

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 孤雌胚胎的培养与收集

2.1.2 试验试剂

2.1.3 缓冲液与常用试剂的配制

2.1.4 主要仪器设备

2.2 试验方法

2.2.1 差异表达mRNAs的筛选

2.2.2 差异表达片段的鉴定及测序

2.2.3 CPEB2 cDNA的克隆

2.2.4 不同阶段胚胎中CPEB2的荧光定量PCR

3 结果与分析

3.1 差异表达mRNA的筛选结果

3.1.1 两组胚胎DDRT-PCR聚丙烯酰胺凝胶电泳的比较结果

3.1.2 差异条带的回收及二次PCR的结果

3.2 差异条带的鉴定、克隆、测序及生物信息学分析结果

3.2.1 探针标记效价的检测结果

3.2.2 反向Northern-blot鉴定结果

3.2.3 阳性片段的克隆及测序

3.2.4 差异表达序列的生物信息学分析

3.3 CPEB2 cDNA克隆结果

3.3.1 细胞RNA提取结果

3.3.2 CPEB2中间片段扩增结果

3.3.3 CPEB2 cDNA 5'末端的扩增（5'RACE）结果

3.3.4 序列拼接

3.3.5 CPEB2的生物信息学分析

3.4 不同发育阶段胚胎CPEB2的荧光定量PCR结果

3.4.1 标准曲线的绘制结果

3.4.2 不同阶段胚胎CPEB2的定量结果

4 讨论

4.1 DDRT-RCR技术及结果鉴定

4.2 试验材料的选择

4.2.1 胚胎卵裂时间点的划分

4.2.2 孤雌胚胎的选择

4.3 关于差异表达mRNA片段

4.4 猪CPEB2功能的预测

4.4.1 猪CPEB2 cDNA和蛋白序列分析

4.4.2 不同阶段胚胎中CPEB2表达规律的分析

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的学术论文