人/猴嵌合免疫缺陷病毒p27蛋白单克隆抗体抗原表位的鉴定

摘要

人/猴嵌合免疫缺陷病毒(simian/human/immunodeficiency virus,SHIV),是通过基因重组技术,用HIV-1(hunman imrnunodeficiency viruses-1)的囊膜蛋白基因(env)和部分辅助基因与SIV(simian immunodeficieney viruses)相应基因进行置换,获得的嵌合型病毒。SHIV具有亲本HIV-1和SIV毒株相似的生物学特性,可以在非人灵长类(NHP)动物上模拟HIV-1感染,为研究HIV-1致病机制及疫苗开发提供了重要的模型。SHIV的衣壳蛋白p27构成病毒粒子双层壳的内壳,而且与同属病毒的衣壳蛋白具有相同或相似的抗原性,故可作为SHIV抗原检测的标志物。利用p27抗原和及其抗体,可以在细胞和机体水平对SHIV感染NHP模型进行研究,为艾滋病疫苗研发、免疫策略的有效性以及相关基础研究进行评价。因此,鉴定p27抗原表位对于进一步研究其蛋白结构与功能、开发早期诊断试剂具有重要意义。
　　 本研究用Protein A Sepharose CL-4B柱子对前期工作中已制备的3株p27蛋白单克隆抗体(monoclonal antibody,Mab)p27-A5、p27-C7和p27-D2进行纯化,通过ELISA相加试验对3株单克隆抗体进行抗原结合位点的结合试验。为了对3株单抗结合的抗原表位进行精确鉴定,将该序列分为相互重叠15bp的3个基因片段,分别命名为p27-a(1bp～255bp)、p27-b(241bp～495bp)、p27-c(481bp～741bp),根据每个片段的序列特征设计引物,并分别在三个基因片段中引入BamHⅠ及HindⅢ位点。将3个片段进行PCR扩增后酶切,并分别克隆于与经相同酶切处理的表达载体pET-32a中,经酶切和测序正确的重组质粒,将其进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳分析和Westernblot鉴定。在初步鉴定后,设计了一套总数为16个覆盖整个免疫优势区域的短肽,分别命名为A1～A8、C1～C8,短肽长度均为16aa,部分重叠,对其基因序列进行了直接合成,在5’端和3’端分别引入BamHⅠ和HindⅢ位点。退火后与表达载体pET32a连接,以载体携带的His标签的融合方式,表达短肽,分别命名为A1至A8及C1至C8,表达产物分别进行SDS-PAGE电泳分析和Westernblot鉴定。
　　 本研究结果如下:1.应用ProteinASepharoseCL-4B亲和层析法成功纯化3株单克隆抗体,获得了高纯度的IgG类抗体,3株腹水单克隆体抗纯度达95％以上,可以满足作为检测试剂和其他应用研究的要求。2.确定了单抗p27-A5与p27-C7针对相同或位置相近抗原表位,而另一株单抗p27-D2针对与上述2株单抗不同的抗原表位。3.鉴定出以上3株单抗与p27结合的抗原表位,其中,单抗p27-C7及p27-A5所针对的抗原表位位于p27的61aa～76aa,氨基酸序列为61SEGCTPYDINQpMLNCV76;单抗p27-D2所针对的抗原表位位于p27的191aa～206aa,氨基酸序列为191EQTDAAVKNWMTQTLL206。
　　 综上所述,本研究成功鉴定了3株抗SHIVp27的单抗体所针对的抗原表位。此外,建立了重组蛋白的原核表达,相关检测以及抗体纯化,抗原/抗体免疫检测等技术平台,为研制检测p27的试剂盒和HIV-1疫苗相关研究提供了物质和技术基础。